[发明专利]脂肪干细胞库构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脂肪干细胞库的构建方法。

背景技术

脂肪组织中含有一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪间充质干细胞，简称脂肪干细胞。其生物学性质与骨髓间充质干细胞相类似，并可向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化。

目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法分离获得。相对于骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞有一下优势：1、脂肪组织在体内分布广泛，储量丰富。且脂肪组织取材容易，吸脂手术属于技术成熟的常规手术，手术风险小，患者痛苦少，这一点尤其利于临床应用；2、脂肪干细胞的获取效率要优于骨髓间充质干细胞。 细胞克隆形成实验表明，间充质干细胞只占到成人骨髓的（0.2～1）×10^-5。而脂肪组织经胶原酶消化后，其中主要的细胞 类型脂肪细胞，很容易通过浮力而去掉，所获得的间充质干细胞克隆形成率是骨髓间充质干细胞的100～500倍；3，从临床角度出发，在短时间内更容易获得大量的脂肪干细胞，对于急性心肌梗塞等疾病的快速治疗具有重要意义。在局部麻醉的情况下，成人骨髓的获取量通常不超过40ml，能获得大约1.2×10⁹个有核细胞,其中包含大约2.4×10⁴个MSCs。如果想获得更多的骨髓，则需要全身麻醉，则增加了病人痛苦和发生并发症的风险；而一次吸脂手术可获得超过200ml的脂肪组织，且每100ml都能获得大约2×10⁸个有核细胞，其中含有大约1.2×10⁸的干细胞，相当于相同体积骨髓的2000倍。由此可见，在相同条件下，脂肪组织更具临床应用潜力。

由于脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便创伤小，在组织工程、器官修复、基因治疗等方面都有着广阔的应用前景，因此脂肪间充质干细胞已成为继骨髓间充质干细胞后干细胞领域另一个备受关注的热点。

2012年1月，韩国FDA批准的自体脂肪干细胞药物Cuepistem成功上市，用于治疗复杂性克隆氏病并发肛瘘。同年10月，美国FDA批准了Cytori Therapeutics公司脂肪干细胞对心脏衰竭患者有效性的临床试验。而在中国，大部分吸脂手术中得到的脂肪干细胞均被废弃，得不到有效利用。

为了便于人们有效存储和使用干细胞资源，目前，在世界范围内，已经建立了多个干细胞库。所谓干细胞库是在约-196℃液氮中（深低温）存储干细胞及搜集存储干细胞资源相关资料的场所。目前，国内干细胞库按来源分为脐带血干细胞库、脐带间充质干细胞库、胎盘干细胞库、牙髓干细胞库等；按提供方法又分为自体库和公共库，公共库所存储的干细胞都是他人的干细胞，以满足需要移植但自体干细胞没有保存的病人需求。

中国专利授权公告号CN103074298A的专利公布了一种人脂肪间充质干细胞库及其构建方法，其构建方法由以下步骤组成：1、采集脂肪；2、获取和分离人脂肪成体干细胞；3，培养人脂肪干细胞；4、检测和冻存人脂肪成体干细胞；5、建库。以上构建方法有以下不足：一是耗时长：均是将干细胞制备出后冻存，每份干细胞入库周期长，步骤繁琐。二是成本高：供者将脂肪干细胞捐出后，存在公共库，等待需要的受者使用，在使用前，每份脂肪都制备成干细胞再冻存，所耗用试剂、材料、人工较多，不是每一份干细胞都会用上，这就使得公共库成本增高。

发明内容

    本发明的目的是为了克服现有技术中存在的问题，提供一种脂肪干细胞库构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种脂肪干细胞库构建方法，包括以下步骤：

（1）、采集脂肪：对供者进行HLA分型检测、ABO/Rh血型检测、人源特定病毒包括HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV的检测、梅毒螺旋体感染检测，然后对符合要求的供者在无菌场所采集脂肪；

（2）、用含青霉素和链霉素的PBS反复冲洗脂肪组织，去除残留的血液，将脂肪组织绞碎为0.5～1mm³的脂肪组织微块；

（3）、收集脂肪组织微块，在700g离心10min；

（4）、吸弃下层少量液体，将脂肪组织微块用二甲基亚砜和血清替代品按照1:9的比例混合的冻存液重悬；

（5）、将重悬的脂肪组织微块分装到冻存管中，放入冻存盒，-80℃冰箱过夜，次日转移到液氮保存；

（6）、按照供者HLA分型、ABO/Rh血型和性别进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即完成脂肪干细胞库的构建。