[发明专利]链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于链球菌性乳房炎致病菌检测领域，尤其涉及一种链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒。

背景技术

乳房炎是奶牛场中最普遍也是造成经济损失最严重的疾病之一，制约奶牛养殖业、乳品加工业的健康发展，危害公共卫生安全及人类健康，如何有效预防和控制该病已成为国内外关注的焦点。金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌，这三种病原菌所引起的发病率占奶牛乳房炎总发病率的90%以上。奶牛乳房炎的常见链球菌属致病菌（Streptococcus）主要包括无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、停乳链球菌（streptococcus dysgalactiae）和乳房链球菌（Streptococcus uberis）等，其中无乳链球菌具有高度传染性，其余链球菌多为环境致病菌，均可引起不同类型、程度的乳房炎，造成的经济损失难以估量。致病菌诊断检测是乳房炎治疗和控制方案的基础，及时、准确地鉴别致病菌对治疗有直接影响。如链球菌性乳房炎致病菌主要对青霉素、氨苄青霉素和红霉素敏感，国外报道使用羟氨苄青霉素治疗效果最好。因此，迫切需要建立一种快速敏感的链球菌性乳房炎致病菌检测方法，以实现早期诊断，从而有助于及时采取合理有效的治疗方案，为控制链球菌性乳房炎争取宝贵的时间，提高乳房炎的治愈率，避免因诊断耗时而造成的进一步经济损失。

然而在临床实践中，链球菌属致病菌培养要求条件高、分离鉴定难度大，耗时长，传统病原微生物检查结果易出现误判。以分子生物学PCR为基础的多项检测技术如普通PCR、实时定量PCR、多重PCR，及以抗原检测为主的免疫学检测法，方法快捷、灵敏，准确度较高。但是，这些现代检测方法均需要复杂的仪器设备和技术要求，成本高，不适合基层和现场检测，难以推广普及。

近年来，环介导恒温扩增(loop mediated isothermal amplification，LAMP)方法在微生物检测中的作用日益受到关注。该方法是由日本学者Notomi等在2000年建立的一种新型核酸扩增技术，因具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、无需昂贵仪器等优势，已在诸多领域广泛应用。目前建立的多数LAMP反应方法多采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像、或反应完成后再加入荧光染料来判定结果，只能分析LAMP反应的最终结果，且存在气溶胶污染实验室的危险，由于缺乏对反应的实时监控，很难排除这些干扰因素，因此不能对检测结果做出准确的判定。

目前，国内外均未见有建立链球菌性乳房炎致病菌LAMP可视化检测方法的相关报道。本发明建立的LAMP方法不仅敏感度高，特异性强，而且反应完成后无需开盖，直接肉眼观察反应结果即可。避免气溶胶污染，快速得出检测结果，操作简便，只需按建立的体系加样即可，为简便、快捷、准确地检测链球菌属菌带来便利。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、仪器要求低、操作快速简便且成本低的链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒，以满足基层现场快速检测链球菌性乳房炎致病菌的需要。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒，包括反应液A，反应液A含有10×Bst buffer（等温反应缓存液）、8U/μl Bst DNA聚合酶、10mM dNTPs、100mM MgSO₄、40μM的内引物1、40μM的内引物2、5μM的外引物1、5μM的外引物2、5M甜菜碱Betaine、625μM钙黄绿素、12.5mM MnCl₂；10×Bst buffer含有pH8.8200mM Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH₄)₂SO₄、20mM MgSO₄、1%Triton X-100；

内引物1序列为CCACCTTCTTCTTTAGAAAGGATGTCCAGGTTCAATCAACCCA，

内引物2序列为CGTCATACTCCATTCTTCAACAACTAGTTCGATTGAACCTGTTACG，

外引物1序列为CGTGGTCAAGTTCTTGCTAA，

外引物2序列为ACCATTTCTGTTCCTGCTG。