[发明专利]含有绿色荧光蛋白基因的表达载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种含有绿色荧光蛋白基因的表达载体，其特征在于：所述绿色荧光蛋白基因为sfGFP基因，所述sfGFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的含有绿色荧光蛋白基因的表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

合成核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的sfGFP基因；

合成带有酶切位点的引物，并在此引物的引导下，以核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的sfGFP基因为模板进行PCR扩增，得到带有酶切位点的核苷酸序列，带有酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

将空载质粒以及所述PCR扩增得到的带有酶切位点的核苷酸序列分别进行双酶切并回收酶切后片段，用DNA连接酶连接酶切后片段，并用于转化大肠杆菌；

用含有与空载质粒中抗性基因相对应的抗生素的LB固体培养基进行筛选，挑取发绿色荧光的克隆子检测载体序列，通过基因测序检测正确的载体即为所述的含有绿色荧光蛋白基因的表达载体。

3.如权利要求2所述的含有绿色荧光蛋白基因的表达载体的构建方法，其特征在于：所述空载质粒为pET-28a(+)或pGEX-6P-1。

4.如权利要求2所述的含有绿色荧光蛋白基因的表达载体的构建方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌RosettaBlue(DE3)。

5.如权利要求1中所述的表达载体在阳性克隆子筛选上的应用，其特征在于：步骤如下：

合成目的基因；

合成带有酶切位点的引物，并在此引物的引导下，以合成的目的基因序列为模板，进行PCR扩增得到带有酶切位点的目的核苷酸序列；

将权利要求1中所述的表达载体进行双酶切，然后将酶切得到的质粒片段经过去磷酸化处理，回收去磷酸化的线性质粒片段；将PCR扩增得到的带有酶切位点的目的基因序列进行双酶切，回收酶切片段，用DNA连接酶连接去磷酸化的表达载体片段和目的基因片段，并转化大肠杆菌，用含有与权利要求1中所述的表达载体具有的抗性基因相对应的抗生素的LB固体培养基进行筛选，挑取不发光的斑，即为带有目的基因序列的克隆子。