[发明专利]一种溶藻弧菌检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于病原菌诊断技术领域，具体涉及一种应用LAMP技术检测溶藻弧菌的快速检测试剂盒和检测方法。

背景技术

溶藻弧菌是一种革兰氏阴性条件致病菌，通常人类感染是因为生食海鲜或者伤口接触了带菌的海水或海产品。临床症状主要表现为伤口感染、胃肠炎、中耳炎、眼内炎、食物中毒和败血症等疾病。目前海洋病原菌检测的传统方法主要包括前增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定、血清学鉴定，需5～6天出报告，方法繁琐，费时费力。而PCR方法，虽然快速、敏感、特异，但对操作人员要求较高、且需特殊仪器，同样不适合现场检测。

环介导等温扩增( loop-mediated isothermal amplifi-cation，LAMP) 技术是 Notomi 等2000年发明的一种新颖的扩增技术，该技术在具有置换活性的DNA聚合酶( Bst DNA polymerase)作用下，利用特别设计的四段引物识别靶基因的六个区域，恒温条件下进行核酸扩增，以达到对目的基因的高效、特异复制的目的。另外通过环引物的添加，大大加快了反应的速度，整个过程只需要 1～2 h。其结果可以根据反应的副产物白色沉淀焦磷酸镁来判断是否发生扩增，也可以在反应管中加入荧光染料, 反应后观察是否变色来进行鉴别。该检测技术较常规PCR和real-time PCR来说不需要昂贵的设备、特殊的实验室环境和专业技术人员。其突出优点有：操作简便，耗时少，且特异性好、灵敏度高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用LAMP技术对溶藻弧菌进行快速检测的试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

溶藻弧菌快速检测试剂盒（LAMP法），它包括：

（1）6条引物：

表1 溶藻弧菌引物

（2）2*反应缓冲液组分：            

（3）Chelex-100试剂（购自美国Sigma公司）；Bst DNA 聚合酶（购自New England Biolabs公司，8u/ul）；钙黄绿素（购自美国Sigma公司）；

（4）阳性对照DNA，阴性对照DNA。    

上述溶藻弧菌快速检测试剂盒（LAMP法）的检测方法包括以下步骤：

（1） 取各引物干粉，加去离子水配置成100uM保存液，实验时将引物保存液稀释十倍使用。向Chelex-100中加入20ml去离子水，配成5% Chelex100溶液；

（2 取1ml样品菌液离心弃上清，取沉淀，细菌沉淀中加入1ml 5％Chelex100溶液，震荡混匀后置100℃水浴10min，然后立即冰浴1min，4℃ 12000rpm离心10min，取上清即为标本；

（3）    试剂配制（在冰盒上操作）

       试验反应按照下表比例进行配置（1次反应量）

阳性对照反应以阳性对照DNA代替样本DNA；

阴性对照反应以阴性对照DNA代替样本DNA；

空白对照反应以去离子水代替样本DNA；

(4) 扩增反应

将配置好的反应溶液置于恒温金属加热仪中，在63℃的条件下反应40分钟；在80℃条件下恒温5分钟或在95℃条件下恒温2分钟，使酶灭活以终止反应。

（5）结果判断

在DNA延伸合成时，从脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结合会产生一种焦磷酸镁的反应副产物，当在反应前加入钙黄绿素混合液时，颜色会由橙黄色变为草绿色，即溶藻弧菌阳性。

（6）质量控制 

阳性对照管为草绿色，阴性对照管和空白对照管为橙黄色，如图1所示，若实验结果与上述结果不符应重新检测。

（7）检验结果的解释

1） 检测结果为阳性结果的报告，只能说明样本中有细菌DNA的存在；

2）虽然本试剂盒检测溶藻弧菌的灵敏性和特异性较高，但阴性结果并不能排除样本中含有细菌，只能说明样本中细菌含量低于本试剂盒检测的灵敏度。

试剂盒的评价