[发明专利]一种阳离子型聚肽，以及基于所述聚肽的siRNA基因转染试剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种阳离子型聚肽，以及基于所述聚肽的新型siRNA基因转染试剂及其制备方法，具体的说，本发明提出了一种新型的多肽纳米材料，该纳米材料可用作转染试剂。

背景技术

SiRNA转染试剂在生物学领域应用非常广泛，由于基因治疗的关键是如何高效地将基因运送到目的细胞内，所以转染试剂在生物学实验中使用频率极高。目前SiRNA转染试剂主要包括病毒载体和非病毒载体，病毒载体的转染效率远高于非病毒载体，但其免疫毒性和致癌性成为临床应用的最大难题。因此，高效的转染试剂必须具备转染效率高，低毒，生物相容性好的特点。现阶段使用的转染试剂都存在或多或少的缺点，所以需要开发出更加安全高效的转染试剂。

较早使用的转染方法有DEAE-葡聚糖法和磷酸钙法。DEAE-葡聚糖法使用简便，但是对细胞有一定毒副作用，而且一般只用于BSC-1，CV-1，COS细胞系，使用范围较小。磷酸钙法操作简单，但是不适用于原代细胞，重复性差，有些细胞不适用且毒副作用较大，所以这两种方法逐渐被淘汰。

目前应用最多的是阳离子脂质体法，带电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，或者通过细胞的内吞作用进入细胞。这种转染试剂使用方法简单，通用于各类RNA，能转染各类型的细胞，没有免疫原性，虽在体内转染中有很高的效率，但脂质体转染试剂在体内能被血清清除，并在肺组织内积累，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的细胞毒性，很大程度上限制了此转染试剂的应用。

阳离子聚合物是一种新兴的转染试剂，带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞，这种转染试剂除了具有阳离子脂质体的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外，还具有在体内转染效率高，细胞毒性低等特点，所以发展潜力很大。

阳离子型聚肽是阳离子聚合物的一种，与聚乙烯亚胺和聚酰胺树枝状高分子相比同样具有了良好的转染效果，与siRNA的结合力很强，而且在体内可分解为氨基酸，不仅满足了转染需求，同样可作为体内营养物质使用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有转染试剂的不足，提供一种阳离子型聚肽，以及基于该聚肽的阳离子型聚肽siRNA基因转染试剂，所述的转染试剂是一种转染效率高，毒副作用小，且在体内转化成营养物质的新型转染试剂。

本发明的另一目的还在于提供该转染试剂的制备方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种阳离子型聚肽，其特征在于，所述的聚肽为精氨酸、色氨酸和亮氨酸组成的十八肽，其序列为RLWRLLWRLWRRLWRLLR。

本发明的阳离子型聚肽其分子式下式所示，分子量为2648道尔顿。

上述阳离子型聚肽，本领域技术人员可采用现有技术中普通多肽合成法合成。一种方法是通过多肽微波合成法，合成含有精氨酸、色氨酸和亮氨酸三种氨基酸的十八肽。例如，在本发明具体实施例中，所使用的十八肽即采用微波合成法自制，树脂选用氯树脂，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，脱保护选用20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，切割试剂为（87.5mlTFA+2.5mlEDT+5ml水+5ml茴香硫醚+5g苯酚)，合成产物经液相提纯后冻干。合成中所使用试剂均为市场购得。

本发明还涉及一种阳离子型聚肽siRNA基因转染试剂，其特征在于，所述的转染试剂为序列为RLWRLLWRLWRRLWRLLR的阳离子型聚肽溶于无核酶水中的水溶液，其中聚肽自组装成小于200nm的聚肽纳米材料。

所述的阳离子型聚肽siRNA基因转染试剂，阳离子聚肽的浓度优选为0.8mg/ml ~1mg/ml。

所述的阳离子型聚肽siRNA基因转染试剂，其临界胶束浓度范围在0.8mg/ml ~1mg/ml。

所述的阳离子型聚肽siRNA基因转染试剂，其包裹力的摩尔比范围为28:1 ~22:1。

所述的阳离子型聚肽siRNA基因转染试剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1）合成序列为RLWRLLWRLWRRLWRLLR的十八肽；

步骤2）将合成的十八肽溶解在无核酶水中，配成浓度为0.8mg/ml ~1mg/ml的溶液；

步骤3）将步骤2所得溶液用超声波清洗仪超声10至15分钟后，用0.22μm的滤膜过滤，4℃保存备用。