[发明专利]抗多环芳烃单克隆抗体与产生该抗体的杂交瘤细胞PYR#1及其应用

权利要求书

1.一种分泌抗多环芳烃单克隆抗体的杂交瘤细胞株PYR#1，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.8551。

2.根据权利要求1所述的抗多环芳烃单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，其制备方法包括如下步骤： 

1)动物免疫 

2)取小鼠脾细胞与SP2／0细胞，采用PEG法进行融合 

3)阳性细胞株筛选 

4)抗体纯化和鉴定，杂交瘤细胞株的筛选与保藏。 

3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，所描述的方法包括如下步骤： 

1)动物免疫 

以“PBA-BSA”作为免疫原，免疫用小鼠为18g左右的BALB／C，7-8周；免疫之前眼眶取阴性血清。取60μg免疫原，用生理盐水稀释到200μl，再加入等体积弗氏完全佐剂进行皮下注射免疫。此后，每隔两周，进行一次加强免疫，免疫量为30μg蛋白／只小鼠。共进行四次加强免疫后，眼眶取血，测定抗血清效价。选择效价较高的小鼠腹腔冲击免疫，免疫量为50μg蛋白／只小鼠。效价达到1：10000即可做细胞融合。 

2)细胞融合 

取免疫小鼠的脾脏细胞与状态良好的骨髓瘤细胞SP2／0，采用PEG法进行融合。融合的细胞用含15％血清的IMDM培养基培养。 

3)阳性细胞株筛选 

以“PBA-OVA”作为检测抗原包被酶标板，对培养于96孔细胞培养板的细胞采用酶联免疫吸附分析(ELISA)方法做第一次筛选。得到阳性杂交瘤细胞株后，再用“PBA-OVA及BSA”再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到的阳性杂交瘤细胞株进行亚类鉴定，选择IgG1类型的阳性杂交瘤细胞株。最后，对已筛选的阳性克隆采用竞争ELISA法进行复筛，选择具有明显竞争反应的细胞株进行后续操作。 

4)抗体纯化和鉴定，杂交瘤细胞株的筛选 

将以筛选到的阳性杂交瘤细胞株PYR#1接种小鼠BALB／C腹腔，制备腹水，采用protein G亲和层析柱进行纯化，得到抗多环芳烃单克隆抗体，间接ELISA法检测纯化后抗体效价可达2×10⁵，采用竞争ELISA法对抗体进行鉴定，选择亲和力较高的抗体进行保藏。 

4.根据权利要求3所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，步骤3)和4)中，所述竞争ELISA方法包括如下步骤： 

以PBA-OVA包被酶标板，100ul／孔，4℃过夜；洗涤2次，用2％脱脂奶粉，37℃封闭2h，200ul／孔，加入竞争物(按照设计比例加入竞争物(芘)，50ul／孔；加入一抗(抗血清纯化抗体按照选定比例稀释后加入)，50ul／孔，37℃孵育1h。设置空白对照和不抑制对照，洗涤2次。加入已稀释的羊抗鼠酶标二抗，100μl／孔，37℃孵育1h，洗涤2次。加入TMB底物显色液显色15min，100μl／孔。再加入0.5mol硫酸终止显色，双波长(450，630)测定吸光值，记录保存数据。 

5.权利要求1所述的杂交瘤细胞株所分泌的抗多环芳烃单克隆抗体。 

6.权利要求5所述的单克隆抗体在多环芳烃类化合物检测中的应用。 

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的单克隆抗体在制备检测多环芳烃检测试剂盒中的应用。