[发明专利]一种T-发卡结构介导的测定DNA侧翼未知序列的方法

权利要求书

1.一种T-发卡结构介导的测定DNA侧翼未知序列的方法，其特征在于：合成一条极易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列(HSO-T)，经变性、退火可形成稳定的HSO-T接头；基于发卡结构序列，合成特异性引物THSO-F，再根据已知的DNA序列，合成两条特异性下游引物和两条上游引物；选择单一限制性内切酶酶切基因组DNA，根据酶切产物末端的类型，选择rTaq或Ex Taq进行修饰，修饰后其3′端均被添加上碱基“A”；将HSO-T接头与经Taq处理的酶切产物进行连接；以连接物为模板，采用THSO-F和两条下游引物进行巢式PCR扩增，获得已知DNA序列5′端侧翼未知序列；同理，采用THSO-F和两条上游引物进行巢式PCR扩增，获得3′端侧翼未知序列：

(1)T-发卡结构及PCR引物的合成：根据原核生物回文结构的原理，合成一条极易形成发卡结构的、3′端含有“T”的寡聚核苷酸序列，命名为HSO-T(42bp)；基于HSO-T序列，合成一条特异性PCR引物，命名为THSO-F(20bp)；

HSO-T：5′-GACTACTGGCATGGGCGGATTACTCGCCCATGCCAGTAGTCT-3′

THSO-F：5′-ACTCGCCCATGCCAGTAGTC-3′

(2)上下游引物的合成：基于已知的DNA序列，合成两条扩增已知DNA序列5′端侧翼未知序列的特异性下游引物，命名为Pri-R1和Pri-R2，Pri-R2距离已知DNA序列5′端30bp以上；同理，基于已知的DNA序列，合成两条扩增3′端侧翼未知序列的上游引物，命名为Pri-F1和Pri-F2，Pri-F2距离3′端30bp以上；

(3)限制性内切酶的选择：分析已知DNA序列中限制性内切酶的酶切位点，选择在已知DNA序列中没有酶切位点的限制性内切酶；本发明可供选择的、产生5′粘性末端的内切酶有EcoR I、HindIII、Bgl II、Sal I、BamH I、Nco I、Xba I、Xho I、Cla I、Msp I和Nde I等，产生平末端的酶有EcoR V、Sna B和Sca I等，产生3′粘性末端的酶有Aat II、Bmt I、Pst I、Sac I和Sph I等；

(4)基因组DNA的酶切：采用步骤(3)选择的单一限制性内切酶对基因组DNA进行完全酶切，纯化酶切产物；

(5)酶切产物的修饰：基因组DNA经限制性内切酶酶切后，其酶切产物两端有3种形式，分别为5′粘性末端、3′粘性末端和平末端；针对5′粘性末端，利用rTaq或Ex Taq DNA聚合酶具有不依赖于模板的5′→3′核苷酸聚合活性，将粘性末端补齐，并在3′端添加上碱基“A”；针对平末端，直接利用该两种酶在3′端添加上碱基“A”；针对3′粘性末端，利用Ex Taq DNA聚合酶具有3′→5′核苷酸外切活性，将粘性末端切齐，再利用该酶均具有不依赖于模板的5′→3′核苷酸聚合活性，在3′端添加上碱基“A”；

(6)HSO-T接头与酶切修饰产物的连接：HSO-T经变性、退火形成HSO-T接头，将其与经Taq处理的基因组酶切片段进行连接，即可作为PCR扩增的模板；

(7)目的DNA片段的PCR扩增：以步骤(6)的连接物为模板，THSO-F和Pri-R1作为上下游引物进行第一轮PCR扩增；再以该轮PCR产物为模板，THSO-F和Pri-R2为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR(巢式PCR)产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；根据巢式PCR原理验证扩增产物是否为目的DNA片段，从而获得已知DNA序列5′端侧翼未知序列；

同理，以步骤(6)的连接物为模板，Pri-F1和THSO-F作为上下游引物进行第一轮PCR扩增；再以该轮PCR产物为模板，Pri-F2和THSO-F为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，从而获得已知DNA序列3′端侧翼未知序列。

2.根据权利要求1所述的方法，操作过程中所使用的反应体系和条件如下：

(1)HSO-T接头的构建：HSO-T(100μmol／L)2μL，ddH₂O8μL，混匀；使用PCR基因扩增仪94℃变性3min，缓慢降温(1℃／s)至25℃后，恒温退火30min；

(2)基因组DNA的酶切：酶切反应体系和条件为：10×Buffer1μL，限制性内切酶0.5μL，基因组DNA5μL，ddH₂O2.5μL；30或37℃反应4h；其中10×Buffer的类型和酶切温度需与所选内切酶相匹配；

(3)酶切产物的修饰：酶切产物20μL，10×PCR Buffer2.5μL，dNTP0.5μL，rTaq或Ex Taq0.25μL，ddH₂O1.75μL；使用PCR基因扩增仪72℃反应10min；

(4)酶切修饰产物与HSO-T接头的连接：酶切修饰产物5μL，HSO-T接头3μL，10×Ligase buffer1μL，T4DNA Ligase1μL；16℃反应4h或过夜，即可作为PCR扩增的模板；

(5)已知DNA序列5′端侧翼未知序列的PCR扩增：10×PCR Buffer2.5μL，dNTP1.5μL，连接物2μL，THSO-F0.5μL，Pri-R10.5μL，ddH₂O17.75μL，rTaq酶0.25μL；第一轮PCR扩增产物命名为5′-1st-Out；10×PCR Buffer2.5μL，dNTP1.5μL，5′-1st-Out2μL，THSO-F0.5μL，Pri-R2 0.5μL，ddH₂O17.75μL，rTaq酶0.25μL，第二轮PCR扩增产物命名为5′-2nd-In；

(6)已知DNA序列3′端侧翼未知序列的PCR扩增：10×PCR Buffer2.5μL，dNTP1.5μL，连接物2μL，THSO-F0.5μL，Pri-F10.5μL，ddH₂O17.75μL，rTaq酶0.25μL；第一轮PCR扩增产物命名为3′-1st-Out；10×PCR Buffer2.5μL，dNTP1.5μL，3′-1st-Out2μL，THSO-F0.5μL，Pri-F20.5μL，ddH₂O17.75μL，rTaq酶0.25μL，第二轮PCR扩增产物命名为3′-2nd-In。