[发明专利]一种检测进展性肝病相关乙肝病毒前S区变异的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒变异的试剂盒，尤其是一种检测进展性肝病相关乙肝病毒preS变异的试剂盒。

背景技术

全世界有约超过30亿人感染乙型肝炎病毒，乙型肝炎病毒突变是乙型肝炎病毒阳性肝病（包括乙型病毒性肝炎、肝硬化和肝细胞癌）的重要危险因素之一，随着感染的持续，肝脏疾病在从乙型病毒性肝炎向肝硬化和肝癌的发展过程中，病毒的突变率逐渐增加。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)属嗜肝病毒科(hepadnaviridae)中正类嗜肝病毒属(orthohepadnavirus)，HBV DNA有不完全的环状双链DNA组成，长的为负链，短的为正链，负链约含3200碱基（bp），正链的长度可变，相当于负链的50%～80%，HBV基因组中包含4个开放读码框（open reading frame，ORF），均位于负链，分别是S区、C区、P区和X区，其中S区又分为前S1、前S2和S三个编码区，分别编码preS1、preS2和HBsAg蛋白，C区又可分为前C区（precore）和核心区（core），分别编码HBeAg和HBcAg。根据基因差异率超过8%，可将乙型肝炎病毒分为A-H八个基因型。感染乙型肝炎病毒可引起急慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。中国是乙肝流行的高发区之一，中国第三次乙型肝炎血清流行病学调查显示中国平均感染率为7.8%，每年有超过20万人罹患肝癌死亡。肝脏细胞持续受到损害，会导致肝脏细胞坏死，最终导致肝硬化及肝癌的发生。因此，研究快速、准确检测肝脏持续感染状态的方法对于降低肝脏损伤，降低肝硬化和肝癌的发生具有重要意义。目前通常把慢性乙肝、肝硬化和肝癌统称为进展性肝病。

目前常用的检测乙肝病毒进展性肝病的方法主要是检测血液中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)。作为肝脏损伤的最敏感的指标之一，ALT的升高说明肝脏炎症的存在。但是，ALT的升高可能是由多种原因导致的，比如急性和慢性病毒性肝炎、饮酒和药物引起的肝脏损伤、肝内外胆汁淤积等等，尚待做进一步的检查才能明确ALT升高的原因。因此，急需一种快速、准确的检测方法，用于说明炎症的持续存在是由于乙型肝炎病毒阳性肝病患者的乙肝病毒的复制、变异导致的。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)技术具有快速、成本低、灵敏度高等优点，针对突变部位设定相应的特定引物，利用引物和模板的特异性结合，然后通过琼脂糖凝胶的方法，鉴定目的条带。适用于基层及现场的快速、准确检测。

因此临床急需检测进展性肝病（检测肝脏炎症持续存在）的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供乙型肝炎病毒前S区变异位点在制备检测进展性肝病试剂盒中的应用，并提供了一种检测进展性肝病相关乙肝病毒前S区变异的试剂盒。

在乙型肝炎病毒特定的区域，如preS区的某些特定位点的突变与乙型肝炎病毒阳性肝病，尤其是肝细胞癌的发生具有重要联系。在preS区中，一些重要的突变如A31T,T49A,A52C,G105C,C109A,A135C和G147C的突变频率在ASCs中非常的低（HBV B型中0.0%，C型中0.0%-4.2%），但是在慢性乙肝患者、肝硬化患者和肝癌患者中突变频率接近100%（HBV B型中92.3-100.0%，C型中89.7%-100.0%）。这些重要的突变能够在急性感染后的ASC状态下被选择出来，并且在后续的HBV进化过程中持续保持。在检测中发现这些突变，能够很好的将无症状携带者与慢性活动性乙肝、肝硬化和肝癌患者区分开来，说明肝脏炎症持续存在，肝脏细胞持续受到损伤，具有重要临床意义。

本发明的第一方面，是提供乙型肝炎病毒前S区变异位点在制备检测进展性肝病试剂盒中的应用，所述的乙型肝炎病毒前S区（preS区）变异位点是指A31T,T49A,A52C,G105C,C109A,A135C和G147C。

所述的检测进展性肝病是指检测肝脏炎症持续存在。

所述的乙型肝炎病毒前S区变异位点的序列如下：

本发明的第二方面，是提供一种检测进展性肝病相关乙肝病毒前S区变异的试剂盒，该试剂盒的组成包括：

1.PCR引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

引物序列如表1所示，

将P1和P2等量混合成PCR引物Ⅰ，为检测A31T、T49A、A52C位点PCR引物；

将P3和P4等量混合成PCR引物Ⅱ，为检测G105C、C109A位点PCR引物；