[发明专利]基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法

权利要求书

1.一种基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，包括以下步骤：

1）将裸金电极抛光，洗涤，然后浸入食人鱼溶液中10～15min，再取出清洗、干燥；

2）将用TE缓冲液配制的巯基标记的适体片段Co3S滴加于上述金电极上，置于4℃冰箱过夜；

3）将步骤2中的金电极取出，冲洗,用6-巯基-1-己醇封闭1～1.5h，再次冲洗金电极，然后用鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液封闭金电极2～3h；

4）将步骤3中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加PB缓冲液配制的生物素标记的适体片段Co3B和待测样品溶液，然后在37℃下反应40～50min；

5）将步骤4中的金电极取出冲洗，加入PB缓冲液配制的链酶亲和素溶液，37℃温育30～45min,取出冲洗；

6）在步骤5中的金电极上加入PB缓冲液配制的环化DNA溶液，37℃温育30～45min，取出冲洗；

7）在步骤6中的金电极上加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应液，37℃滚环扩增1～1.5h，取出冲洗；

8）在步骤7中的金电极上加入用2×SSC杂交液配制的生物素修饰的检测探针，37℃杂交1～1.5h，用DEA缓冲液清洗电极；

9）在步骤8中的金电极上加入用含有0.8%BSA的DEA缓冲液配制的1.25μg/mL的ST-AP，37℃反应30～45min，用DEA缓冲液冲洗，在用DEA缓冲液配制的0.75mg/mLα-NP底物溶液中进行示差脉冲伏安法DPV信号检测，根据标准曲线，得到待检样品中可卡因的浓度。

2.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述步骤1中金电极抛光用粒度为0.05μm的氧化铝粉，所述的食人鱼溶液为浓H₂SO₄:H₂O₂体积比为3:1的溶液。

3.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述的巯基标记的适体片段Co3S序列为：5’-GGGAGTCAAGAACGAAAAAAAA-thiol-(CH₂)₃，生物素标记的适体片段Co3B序列为：5’-TTCGTTCTTCAATGAAGTGGGACGACAAAAAAA-biotin，检测探针序列为：5’-Biotin-AAAAAAGCGCAGAATGGT，制作环化DNA时所用的引物DNA序列为：5’-Biotin-AAAAAAAAAAAACAGGGCTGGGCATAGAAGTCAGGGCAGAGA，待环化模板DNA序列为：5’-P-TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCAGAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATCTGCCCTGACTTC。

4.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述步骤3至7中金电极的冲洗按照如下步骤完成：先用含0.005%吐温20Tris-HCl缓冲液冲洗三次，然后再用Tris-HCl缓冲液冲洗三次；Tris-HCl缓冲液为含有20mM Tris，0.1M氯化钠，5mM氯化镁，pH 7.4。

5.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述步骤3中的鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液按浓度为10mg/ml的鲑鱼精DNA与2%BSA体积比为1:80混合配制。

6.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述步骤4中的待测样品溶液的制备方法为：将尿液离心，取上清，然后用PB缓冲液按体积比1:3稀释；所述步骤4）、5）、6）中的PB缓冲液为含有5mM氯化钾，5mM氯化镁，40μM TCEP，0.1M磷酸盐，pH 7.4。

7.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述步骤7中的滚环扩增反应液中含33mM Tris,10mM氯化镁,66mM氯化钾,1mM二硫苏糖醇,0.1%吐温-20，pH 7.9。