[发明专利]一种汉逊酵母HCP抗体制备方法，制得抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药及检测技术领域，具体地说，涉及一种检测用抗体的制备方法，更具体地说，涉及一种汉逊酵母HCP(Host cell protein，HCP，宿主蛋白)抗体的制备方法，该方法制备所得抗体，以及该抗体在相关检测技术中的应用。

背景技术

酵母菌作为单细胞真核生物，既具有原核生物生长快，遗传操作简单的特点，又具有与高等真核生物相似的基因表达调控和翻译后修饰机制，因此是生产具有真核生物活性蛋白理想的表达系统。其中多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)是国际上公认的一种理想的外源基因表达系统，优于大肠杆菌和其他酵母菌的外源基因表达系统，近年来已有大量难以高效表达的外源蛋白在汉逊酵母表达系统中都得已成功表达；其在生物制品产业化应用价值如下：1)外源基因整合于染色体上，重组菌株遗传稳定性高；2)非同源重组的频率高，易获得高拷贝整合的转化子；3)可利用甲醇氧化酶(MOX)启动子等强启动子高效的启动外源基因的表达；4)外源蛋白的表达在过氧化物酶体内进行，可使其免受细胞内蛋白酶的降解，并降低了对细胞的毒害作用；5)耐高温，最适生长温度为37-43℃，生长速率快，大规模发酵的培养时间短。当前采用多形汉逊酵母作为表达系统已上市的生物制品有重组乙型肝炎病毒疫苗、水蛭素等；另外还有多种外源蛋白在多形汉逊酵母中成功表达的报道。

宿主细胞中含有大量的宿主蛋白(Host cell protein，HCP)、DNA和内毒素等，均可能给生物制品造成污染。其中宿主蛋白潜在的免疫原性有可能诱导机体产生相应抗体，发生免疫反应；而且其潜在的“佐剂效应”也可能会引起机体对药物产生抗体，进而影响药物的疗效。灵敏度高、重复性好的宿主蛋白检测方法不仅是保证生物制品安全有效的关键，也是生产过程控制和工艺优化的重要参数。

目前，酵母宿主蛋白检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、毛细管电泳(CE)、反相HPLC、离子色谱等。《中国药典》三部(2010版)中宿主蛋白残留量检测方法采用酶联免疫法(ELISA)。ELISA检测方法中所用的抗宿 主蛋白抗体通常是将宿主细胞破碎后，经过初步处理得到宿主蛋白，免疫动物后获得。宿主细胞破碎方法包括：有机试剂裂解；溶菌酶等酶类的酶促反应；超声、高压匀浆等物理破碎。初步处理方式包括：固液分离；超滤浓缩等。

常规的酵母HCP抗体制备方法，由于HCP分子量大小不一，成分复杂，各成分之间免疫原性差异大，而不容易得到合适的HCP抗体。这是因为，常规方法将酵母HCP全部成分免疫动物之后，获得抗体主要结合分子量大且免疫原性强的HCP成分，对于低分子量且免疫原性弱的HCP成分无结合能力。使用这种制备方法产生的抗体，会导致在通过ELISA(酶联免疫法)检测生物制品中HCP残留时灵敏度大大降低，并且由于部分低免疫原性的HCP成分无法检测而造成实际测定值偏低。

综合上述，目前尚无一种合适的用于汉逊酵母宿主蛋白残留量检测的汉逊酵母HCP抗体及使用该抗体进行检测的方法，更没有相关的配套试剂及试剂盒。

发明内容

针对现有检测技术存在的上述不足，为了给汉逊酵母发酵生物制品中残留宿主蛋白检测提供一种快速有效、简单可靠、适用大规模推广应用的检测方法，本发明通过对现有汉逊酵母宿主蛋白制备免疫抗体的方法进行改良，所制备得到的抗体具有免疫原性强，检测灵敏度高的特点。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种新型制备汉逊酵母HCP抗体的方法，通过在常规免疫动物的方法中加入抗原纯化步骤，使得动物在对汉逊酵母全部宿主细胞产生免疫反应后，加强对于部分较弱免疫原性宿主蛋白的免疫反应性，从而制得低免加强型HCP抗体；

作为一种优选方案，所述新型制备汉逊酵母HCP抗体的方法，具体步骤如下：

a)取2～4种常用汉逊酵母菌种分别进行种子培养和诱导表达，诱导表达48～90小时之后，收集菌体；

b)将上述分别诱导表达的菌体，各取相等的重量进行混合，细胞破碎，固液分离，收集破菌上清，过滤除菌，制得混合汉逊酵母HCP全蛋白；

c)使用混合汉逊酵母HCP全蛋白加上合适的佐剂免疫动物，共三次免疫，获得中间抗体；

d)使用中间抗体制备亲和层析胶，亲和纯化汉逊酵母HCP全蛋白，获得汉逊酵母HCP低免蛋白；

e)使用汉逊酵母HCP低免蛋白在步骤c)的基础上继续免疫动物，共三次，获得汉逊酵母HCP低免加强型抗体；