[发明专利]一种海洋低温碱性脂肪酶BohaiSea‑9145晶体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及海洋微生物领域，特别是涉及一种新型海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体及其制备方法。 

背景技术

脂肪酶作为一个具有上百年历史的古老酶种，近年来随着细胞工程、基因工程、蛋白质工程等技术的兴起，其在生物能源、食品加工及医学工程等领域的应用范围不断扩大、重新焕发出新的活力。目前在美国国立生物信息中心（NCBI）中报道的脂肪酶基因已达4000余个（包括假单胞菌、酵母菌、葡萄球菌、链霉菌和枯草杆菌等众多微生物来源的脂肪酶基因），晶体结构约200个，而且仍在迅猛增加。 

脂肪酶的开发与应用依赖于酶本身的底物特异性，而脂肪酶的底物特异性取决于酶的分子结构，特别是酶活性中心的三维结构。蛋白质的三维结构对于了解其生物功能、设计药物以及蛋白质药物的基因工程等方面具有非常重要的作用。目前，X-射线单晶衍射方法是通过蛋白质单晶获得其三维结构的最重要的研究方法之一。对于X-射线单晶衍射方法，蛋白质单晶必须达到足够大的尺寸和完善程度。然而，由于溶液中蛋白质分子之间的相互作用位点较少，相互作用力比较弱，蛋白质晶体中往往含有很大比重的水，因此，内部结构比较规整的蛋白质晶体仍旧很难获得。获得高质量的蛋白质晶体仍旧是蛋白质结构解析的瓶颈问题。 

海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145是一类重要的生物催化剂，具有低温催化活力高、在碱性条件下性质稳定、与金属离子及表面活性剂配伍性好等一系列优点，可以被广泛应用于日化、食品加工及医药等低温催化领域，具有极大的市场前景与应用潜力。然而该酶对中、短链（C≤12）的底物有较好的水解能力，对大分子底物的催化效果并不理想。因此，对海洋酵母脂肪酶Bohai Sea-9145开展晶体培养及结构解析，对确定其活性中心、底物结合模式、深入研究其催化机制以及小分子抑制剂的设计具有重要的理论指导意义和医学应用价值。经文献检索，未发现与本发明的海洋脂肪酶Bohai Sea-9145晶体结构相同的公开文献报道。 

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足,发明人在长期从事海洋微生物的开发、生产及应用实践过程中，采用现代科学技术，在已筛选得到的适冷性海 洋酵母Bohai Sea-9145的低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145及其基因序列的前期专利基础上,开发提供一种新型海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体及其制备方法。 

本发明的新型海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体的制备方法,包括下列步骤： 

1）结晶（生长）缓冲液的配制 

结晶缓冲液由沉淀剂硫酸铵和pH值缓冲液组成，所述沉淀剂硫酸铵使所述蛋白质从水溶液中沉淀出来的中性盐，质量百分含量为20-30%;所述pH值缓冲液为乙酸钠溶液，缓冲液的摩尔浓度为0.1-0.3M,pH值4.0-5.2;优选为：摩尔浓度为0.1M、pH为4.6的乙酸钠缓冲液，其中含沉淀剂硫酸铵质量百分含量为20%; 

2）海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145水溶液的配制 

将酶活力为4000U/mL的海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145配制成浓度为10-20毫克/毫升的水溶液；优选为：将酶活力为4000U/mL海洋低温碱性脂肪酶BohaiSea-9145配制为10mg/ml水溶液。 

3）结晶液的配制： 

将步骤2）的海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145水溶液按体积比1：1进行接种到步骤1）的晶体缓冲溶液中；采用悬滴法将所述结晶液置于培养箱中，15-25℃培养3-5天得到海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体。优选为：由上述步骤配制的1μL结晶缓冲液、1μL20mg/ml的海洋低温碱性脂肪酶水溶液；利用悬滴法，将上述结晶液置于塑料盖玻片上，然后将该结晶液滴倒扣于24孔结晶板上，中间缝隙用凡士林密封，至于20℃的生物培养箱进行晶体培养，三天后置于偏光显微镜下采集晶体照片，如图1所示，所得晶体为短棱柱状形貌。