[发明专利]一种抗真菌肽高产菌株及其制备抗菌肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及芽胞杆菌属的一株抗真菌肽高产菌株芽胞杆菌BH072（Bacillus sp.BH072）新菌株及通过培养该菌株制备抗菌肽伊枯草菌素A（iturin A）的方法。 

背景技术

真菌在自然界广泛存在，据报道自然界大约有一百五十万种真菌，目前已知的仅有七万四千种。有些真菌可以引起植物病害，导致农作物减产，造成巨大的经济损失。所以控制粮食作物和食品中真菌污染，控制其生长繁殖和毒素的产生是我们面临的一个十分艰巨的任务。真菌的生物控制方法中，抗真菌肽的研究尤其成为当前研究的热点。据APD（the Antimicrobial Peptide Database）数据库记载，从人类、动物、爬行动物、鸟类、昆虫和微生物等不同生物分离出了756种不同的抗真菌肽。据报道，芽胞杆菌、假单孢菌、链霉菌、曲霉、食用菌等微生物均可产生具有不同杀真菌作用的抗真菌肽。其中尤以芽胞杆菌产生的抑菌物质种类多，芽胞杆菌产生的抗真菌物质有核糖体合成的抑菌蛋白和非核糖体合成的抗生素两种类型。核糖体合成的抑菌蛋白主要有细菌素、细胞壁降解酶类（如蛋白酶、几丁质酶、β-1，3-葡聚糖等）以及一些未鉴定的抑菌蛋白等。对细菌和真菌具有不同程度抑菌作用。非核糖体合成的抗生素主要是脂肽抗生素。芽胞杆菌产生的脂肽类抗生素有表面活性素（Surfactin）、伊枯草杆菌素（Iturins）和芬枯草菌素（Fengyein）三大类。脂肽类抗生素大多是带有D型和L型氨基酸的环肽，带有一个脂肪酸链，对丝状真菌和酵母都表现抑菌活性。 

芽胞杆菌分布广泛，是土壤和植物体表根际的重要微生物种群，多数对人畜无毒无害，不污染环境，一些菌株产生拮抗有害病菌的抑菌物质。而且，芽胞杆菌对营养要求低，生长繁殖快，能产生耐热性内生芽胞，抗逆能力强，可以耐受各种不良环境。同时芽胞杆菌因其抑菌谱广且对多种植物病害具有较好防效而引起广泛注意。由于以上特点，芽胞杆菌成为了生物食品防腐和生物农药的研究热点。 

抗真菌肽抑制病原菌孢子产生和萌发，使得菌丝畸形；或通过阻止、破坏真菌细胞壁的合成，在脂膜上形成孔洞，使重要的内容物外泄，导致真菌死亡；有的与真菌细胞内线粒体、核酸作用导致真菌死亡。归纳起来，在抑菌物质的抑菌机理研究方面有三个假说，一是攻击细胞的细胞膜，比较公认的是所谓的桶板模型(barrel-stave model)理论，通常带正电荷的含α-螺旋抑菌肽单体与细胞膜上带负电荷的磷脂分子相互吸引而结合在细胞膜表面，多个抑菌肽分子形成多聚体,扰乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排序，并以与膜表面垂直的排列方式将疏水基团插到磷脂双分子层,形成横跨细胞膜的离子通道,造成细胞质物质泄漏和电化学势丧失,细胞膜崩解而导致细胞死亡；二是抑制细胞壁的合成，如棘球白素(echinocandins)是1，3-β-葡聚糖合成酶的抑制物，通过抑制葡聚糖的合成而抑制真菌细胞生长；三是作用于胞内DNA、RNA、酶和蛋白质等分子，使其失去活性，从而达到杀菌作用。 

迄今为止，国内外多家实验室通过分离纯化芽胞杆菌的发酵产物，得到了一些高分子量蛋白类的抗菌物质和低分子量的抗菌肽。Caldeira等分离到一株解淀粉芽胞杆菌CCMI1051（Bacillus amyloliquefaciens）对根霉L-122（Rhizopus sp.）和哈茨木霉CCMI783（Trichoderma harzianum）等具有强烈的抑制作用，Arrebola等报道解淀粉芽胞杆菌PPCB004可抑制Penicillium crustosum Thom等青霉属真菌的菌丝延伸，Lee等发现缓病类芽胞杆菌WJ5（Paenibacillus lentimorbus）菌株抑制灰霉（Botrytis cinerea）等多种植物致病菌，其抗真菌活性物质分泌于细胞外，并可被正丁醇提取，权春善等和郝建安等分别分离到对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和茄病镰刀菌（Fusarium solani）等真菌具有强抑制作用的解淀粉芽胞杆菌Q-12菌株和NK10.B菌株。研究表明，芽胞杆菌及其产生的抑菌物质在植物病害生物防治中具有巨大的应用潜力。