[发明专利]一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及适用于双重PCR结合双重焦磷酸测序技术检测RAGE家族基因标签SNP位点的试剂盒及方法。

背景技术

糖基化终产物受体（RAGE）是一个细胞表面分子的免疫球蛋白超家族的有多重配体的成员。自1992年被成功分离以后，越来越多的研究表面RAGE在血管疾病的发病机制中起着重要作用。RAGE不仅在大血管病变的发生过程中起放大血管炎症，加速动脉粥样硬化的作用，还作为一个开关调控着参与血管病变的各种信号的传递过程。不同的生化因素及信号通路产生的信号分子最终都必须通过活化RAGE通路才能参与到糖尿病血管病变过程中去。近几年，RAGE在脓毒症发病机制中的作用也日益受到重视。动物实验发现，盲肠结扎穿孔所致的脓毒症模型中，RAGE^-/-小鼠的存活率显著高于野生型小鼠。即使在致脓毒症模型24小时后注射RAGE的单克隆抗体，仍然可以显著降低小鼠的死亡率。Bopp C等也发现脓毒症患者血浆sRAGE水平显著升高，且与患者临床结局密切相关。这些研究结果提示，RAGE是脓毒症发病环节中的重要分子。

单核甘酸多态性（SNP）是指染色体上单个核苷酸变异引起的群体中DNA序列多态性，具有密度高、遗传稳定、易于自动化分析等特点，被认为是继限制性片段长度多态性、微卫星多态性之后的第三代遗传标记，可用于基因定位、多态性分析等方面，是研究疾病遗传易感性、疾病诊断、药物筛选等的常用指标。目前已发展了20余种SNP检测方法，如直接测序法、探针杂交法、飞行质谱分析法、限制性片段长度多态性分析法等，但因这些方法的费用、准确性和适用规模等方面的缺点，局限了基因多态性与疾病发生、发展和预后的遗传关联研究。而焦磷酸测序技术是新一代基于酶级联反应的DNA序列分析技术，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将DNA单链上的每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术具有其独特的优势，无需电泳、DNA片段无需荧光标记；具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量、灵敏度高等特点，符合临床大样本检测要求。

发明内容

本发明的目的之一在于提供RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的检测方法，其能够简捷、直观、准确的对RAGE标签单核苷酸多态性基因型进行检测和判读结果。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，具体包括以下步骤：1）特异性引物的设计，即根据被证实的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物和测序引物，其中，所述特异性扩增引物中的一条用生物素标记；2）PCR扩增，即以待测标本的DNA为模板，用步骤1）所述的特异性扩增引物进行PCR扩增，得PCR扩增物；3）焦磷酸测序，即将步骤2）所得PCR扩增物采用碱变性使其分开成单链，取其中被生物素标记的单链PCR扩增产物纯化后，与步骤1）所述测序引物进行杂交反应，并分析结果以判断所述待测标本的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点靶单核甘酸是否具备多态性。本技术方案的创新点主要在首次采用采用焦磷酸测序法检测RAGE家族基因的单核甘酸多态性。