[发明专利]一种内切葡聚糖酶生产菌株

说明书

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种内切葡聚糖酶生产菌株。

背景技术

纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖、葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素被它降解后可转化为人类急需的能源、食物、化工原料，对于人类社会解决食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。

纤维素广泛存在于自然界的生物体中，细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的是木霉属、曲霉属和青霉属。

纤维素酶成本高以及酶活力低已经成为制约纤维素酶广泛应用的两大瓶颈，因此构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种内切葡聚糖酶生产菌株。本发明通过将草酸青霉（Penicillium oxalicum）的内切葡聚糖酶基因转化入黑曲霉中，获得高效生产内切葡聚糖酶的黑曲霉工程菌株，从而弥补现有技术的不足。

本发明一方面涉及一种黑曲霉工程菌，其携带有能表达内切葡聚糖酶的重组质粒。

所述重组质粒含有草酸青霉的内切葡聚糖酶基因。

所述内切葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。

所述内切葡聚糖酶的编码核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。

本发明的另一方面涉及上述黑曲霉工程菌在生产内切葡聚糖酶中的应用。

本发明构建的黑曲霉工程菌能高效表达来源于草酸青霉的内切葡聚糖酶基因，摇瓶发酵酶活可达900U/mL；本发明获得的重组内切葡聚糖酶的最适作用pH为4.0，最适温度为45℃，在pH5.0-7.0范围内酶活损失不高于5%，可广泛应用于纺织加工技术领域，具有除毛干净，对织物强力损失小的特点，有利于推广应用。 

附图说明

图1 为黑曲霉EG-1发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，其中泳道1为对照组，泳道2为黑曲霉EG-1发酵上清液，箭头所指处即为重组表达的内切葡聚糖酶。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。

除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 3nd Ed. (Singleton et al., 2006)和COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale et al., 2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。

    下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1 内切葡聚糖酶基因的克隆

1.1  草酸青霉总DNA的提取

将草酸青霉（Penicillium oxalicum）过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS); 然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl 10M NH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000 rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。利用OMEGA公司的E.Z.N.A. Fungal RNA Kit制备草酸青霉的mRNA，其制备过程参照试剂盒的操作手册。

基因克隆

以1.1中提取的草酸青霉基因组总DNA为模板，设计引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃，7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。