[发明专利]制备全肝脏生物支架的试剂盒及全肝脏生物支架制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及肝脏组织工程领域，特别是涉及一种制备全肝脏生物支架的试剂盒及全肝脏生物支架制备方法。

背景技术

目前，原位器官移植是治疗器官衰竭唯一有效的方法，对于合适器官移植的需求远远超过可利用器官的数量，因此，以组织工程和再生医学为基础研究可移植的实质性器官尤为重要。

利用自然的实质器官进行去细胞化处理，就可获得包含着管道网络的完整支架，此方法不仅去除大量的细胞和核性物质，还保留三维的细胞外基质结构。

目前不同的去细胞化方法对生物支架的影响具有较大差别，影响表现为：粘连蛋白及聚糖成分的丢失，胶原网络结构的破坏，这都将改变生物支架的机械力学特性。现有去细胞化过程中需要使用去垢剂，如Triton X-100或十二烷基硫酸钠。去垢剂去细胞的有效性以及对细胞外基质成分的影响具有组织特异性，具体为Triton X-100在去细胞时对胶原成分构成明显的破坏；十二烷基硫酸钠去细胞时会引起韧带结构中的胶原变形以及糖胺聚糖成分的丢失。

细胞外基质成分通常由组织器官固有的细胞合成与释放，且与周围外部环境保持动态平衡。由于细胞外基质是由各个组织器官的原宿主细胞合成，因此，在理论上是一种理想的细胞底物。如何降低去细胞去垢剂对肝脏组织生物学特性的影响，是目前构建全肝脏生物支架亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备全肝脏生物支架的试剂盒及全肝脏生物支架制备方法，其能够降低十二烷基硫酸钠与全肝脏生物支架的接触时间，最大程度的保留肝脏细胞外基质成分，且可完全去除肝脏细胞。

为实现上述目的，本发明采用的一个技术方案是：提供一种制备全肝脏生物支架的试剂盒，包括灌注液Ⅰ和灌注液Ⅱ。

其中，灌注液Ⅰ包括0.2g/L EDTA、25000U/L肝素钠及磷酸缓冲液；灌注液Ⅱ包括2.5g/L十二烷基硫酸钠。

其中，灌注液Ⅰ中磷酸缓冲液的PH=7-8。灌注液Ⅱ的溶剂为PH=7-8的去离子水。

其中，灌注液Ⅰ的配制方法为：将0.2g/L EDTA、25000U/L肝素钠溶于PH值为7-8的磷酸缓冲液中。

灌注液Ⅱ的配制方法为：将2.5g/L十二烷基硫酸钠溶于PH值为7-8的去离子水中。

为实现上述目的，本发明采用的一个技术方案是：提供一种全肝脏生物支架制备方法，包括以下步骤。

第一次灌注：经离体肝脏的门静脉灌注500ml含有0.2g/L EDTA、25000U/L肝素钠及磷酸缓冲液的灌注液Ⅰ，其中，灌注液Ⅰ的灌注速度为15ml/min。灌注液Ⅰ中磷酸缓冲液的PH=7-8。

第二次灌注：在第一次灌注完成后，经离体肝脏的门静脉灌注500ml含有2.5g/L十二烷基硫酸钠的灌注液Ⅱ，其中，灌注液Ⅱ的灌注速度为3ml/min。灌注液Ⅱ的溶剂为PH=7-8的去离子水。

第三次灌注，在第二次灌注完成后，以15ml/min的灌注流速经离体肝脏的门静脉灌注2000ml去离子水，以去除离体肝脏中残留的灌注液Ⅱ，进而获得全肝脏生物支架。

其中，第一次灌注、第二次灌注及第三次灌注均通过在离体肝脏门静脉中置管的方式进行灌注。

本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明用于制备全肝脏生物支架的试剂盒包括灌注液Ⅰ和灌注液Ⅱ，其中，灌注液Ⅰ包括0.2g/L EDTA、25000U/L肝素钠及磷酸缓冲液，灌注液Ⅱ包括2.5g/L十二烷基硫酸钠。利用本试剂盒的灌注液来制备全肝脏生物支架，具体为灌注液Ⅰ以15ml/min的灌注流速经离体肝脏的门静脉对离体肝脏进行灌注，灌注液Ⅱ以3ml/min的灌注流速经离体肝脏的门静脉对离体肝脏进行灌注。通过上述试剂盒及灌注液Ⅱ3ml/min的灌注流速，能够降低十二烷基硫酸钠与全肝脏生物支架的接触时间，使制备的全肝脏生物支架最大程度的保留肝脏细胞外基质成分，并可完全去除肝脏细胞。

附图说明

图1是本发明制备的全肝脏生物支架的结构图；

图2是本发明制备的全肝脏生物支架免疫荧光染色后层粘连蛋白的分布图；

图3是本发明制备的全肝脏生物支架免疫荧光染色后胶原蛋白IV的分布图；

图4是本发明制备的全肝脏生物支架免疫荧光染色后胶原蛋白I的分布图；

图5是本发明制备的全肝脏生物支架免疫荧光染色后纤维连接蛋白的分布图；

图6是本发明制备的全肝脏生物支架免疫荧光染色后弹性蛋白的分布图；

图7是本发明制备的全肝脏生物支架的电镜扫描图一；