[发明专利]小麦成熟胚愈伤组织基因枪遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种小麦成熟胚愈伤组织基因枪遗传转化方法。

背景技术

小麦是重要的粮食作物之一，自1992年Vasil等将GUS/Bar基因导入小麦幼胚愈伤组织、通过转化细胞的再生获得首例转基因小麦以来，转基因小麦研究有了长足的发展，尽管小麦转基因方法报道不少，但基因枪转化（microprojectile bombardment）仍然是小麦遗传转化最有效的技术。目前，小麦基因枪遗传转化的主要受体为发育13天左右的小麦幼胚诱导的愈伤组织，但这一重要外植体的来源受到小麦生长季节及时段的影响，应用上很不方便，小麦成熟胚主要来自于收获或储藏的小麦种子，其取材不受小麦生长季节和时段的影响，非常方便，但小麦成熟胚愈伤组织诱导及再生能力极差，影响了这一技术的应用，尽管目前通过培养条件和培养基的改进，是小麦成熟胚诱导的愈伤组织基本可以达到基因枪遗传转化的水平，但与幼胚愈伤组织相比，还有巨大差距。研究、探索小麦成熟胚高效离体培养、再生和转化的条件，使其达到小麦幼胚愈伤组织诱导、再生和转化的水平，可为小麦外源基因的遗传转化和应用建立重要的技术基础。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种小麦成熟胚愈伤组织高效诱导、再生和转化的方法，该方法主要通过小麦成熟胚培养的前处理、有机物的添加及培养、转化技术过程的优化，获得了与小麦幼胚愈伤组织诱导、再生和转化效率相近的技术效果，克服小麦成熟胚愈伤组织诱导难、再生特性差、转化效率低及转化受体组织取材受生长季节、时段影响的缺陷。

为实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

一种小麦成熟胚愈伤组织基因枪遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）成熟胚的选择与预处理：

选取当年收获或储藏1年左右、籽粒饱满的小麦种子，用无菌水冲洗2次，在无菌条件下，用质量分数为70%的酒精消毒5min，然后在浓度为0.1%的升汞溶液中浸泡种子15min，无菌水冲洗4次；

消毒后的小麦种子置10mg/L的噻二唑苯基脲（TDZ）溶液中于25℃室温条件下预处理15h；

2）接种与愈伤组织的诱导：

预处理后的小麦种子用浓度为0.1%的升汞溶液再次消毒10min，无菌水洗4次，于无菌条件下剥取成熟胚，接种于成熟胚愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；

所述的小麦成熟胚愈伤组织诱导培养基以通用MS培养基为基准，添加以下物质：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）：2.0mg/L，盐酸硫胺素（VB1）：8.0mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L-天门冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺：200mg/L，蔗糖：15000mg/L，麦芽糖：15000mg/L，琼脂：5000mg/L；

通用培养基MS的配方为：硝酸钾（KNO₃）：1900mg/L，硝酸氨（NH₄NO₃）：1650mg/L，氯化钙（CaCl₂·2H₂O）：440mg/L，硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）：370mg/L，磷酸二氢钾（KH₂PO₄）：170mg/L，硫酸亚铁（FeSO₄·7H₂O）：27.8mg/L，乙二酸四乙钠（Na₂EDTA）：37.3mg/L，硫酸锰（MnSO₄·4H₂O）：22.3mg/L，硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）：8.6mg/L，硼酸（H₃BO₃）：6.2mg/L，碘化钾（KI）：0.83mg/L，钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）：0.25mg/L，硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）：0.025mg/L，氯化钴（CoCl₂·6H₂O）：0.025mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L。

调整成熟胚愈伤组织诱导培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅（压力：1.0kg／cm²）灭菌20分钟；

3）高渗培养：