[发明专利]一种番茄褪绿病毒的逆转录环介导等温检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种番茄褪绿病毒的逆转录环介导等温检测方法。

背景技术

番茄褪绿病毒（Tomato Chlorosis Virus,ToCV）为长线形病毒科（Closteroviridae）毛型病毒属（Crinivirus）成员，主要侵染番茄和辣椒，在农业生产上造成严重危害。该病毒于1998年在佛罗里达州首次报道，然后在法国、意大利、巴西、以色列等世界各地相继发现，可侵染番茄等重要农作物，在番茄上产生的典型症状为发病初期叶片脉间变黄，后期叶片发红，叶脉颜色加深，叶片增厚，极大降低了番茄产量与品质。番茄褪绿病毒可通过多种方式传播，包括种苗调运、粉虱带毒等。

目前，ToCV在中国仅有2例报道，分别为山东和北京，且在山东多个番茄产区都已检测到，该病毒可造成番茄减产甚至绝产的严重后果。

环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)最早是由Notomi T等在2000年发明的，是一种基于高灵敏链置换技术的恒温核酸扩增方法，其工作原理为：针对靶基因的6个区域设计了4个特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶-Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase在恒温(65℃)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，反应产物既可通过电泳紫外观察，亦可通过荧光染色直接目测。该方法操作简便，无需特殊仪器(如PCR仪)，而且检测结果准确，是一种快捷而有效的检测方法。目前已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病的检测和快速诊断。该方法应用范围广泛，适于基层实验室进行快速检测。

由于ToCV为国内新发现的病毒，所以国内对于该病毒的研究较少，目前国际上对于该病毒的检测还仅仅限于分子生物学检测方法，其中以RT-PCR最为常见，但是PCR需要30-35个循环反应（较费时）及特殊的仪器（PCR仪）且操作程序繁琐复杂、时间长，对检测人员有较高的技术要求，大大限制了作为快速诊断方法的使用和推广。而LAMP方法很好的克服了当前这类方法的不足，LAMP技术反应时间短，无需特殊仪器，检测灵敏度高，特异性好，目前尚未见利用LAMP技术检测番茄褪绿病毒的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种番茄褪绿病毒的逆转录环介导等温检测方法。

本发明提供的一组引物，由如下（1）-（4）所示的DNA分子组成：

（1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；

（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子；

（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；

（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子。

一种检测番茄褪绿病毒的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含所述的引物、反转录酶和Bst DNA聚合酶；

所述反转录酶为M-MLV反转录酶或AMV反转录酶。

一种检测番茄褪绿病毒的方法也属于本发明的保护范围，该方法是以待测样品的总RNA为模板，以所述的引物为引物进行逆转录环介导等温核酸扩增，若得到逆转录环介导等温核酸扩增产物，则所述待测样品中候选含有番茄褪绿病毒，若得不到逆转录环介导等温核酸扩增产物，则所述待测样品中候选不含有番茄褪绿病毒。

上述方法中，所述逆转录环介导等温核酸扩增产物是否得到的判断方法为如下（1）和/或（2）：

（1）将逆转录环介导等温核酸扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，具有弥散状核酸电泳条带的待测样品为含有番茄褪绿病毒的样品，不具有弥散状核酸电泳条带的待测样品为不含有番茄褪绿病毒的样品；

(2)将逆转录环介导等温核酸扩增反应产物与SYBR Green I反应得反应液，反应液呈翠绿色的待测样品候选为含有番茄褪绿病毒的样品，反应液呈橙色的待测样品候选为不含有番茄褪绿病毒的样品。

上述任一所述的方法中，所述引物中SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为外引物，SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子为内引物；

所述外引物中SEQ ID No.1所示的DNA分子与SEQ ID No.2所示的DNA分子在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比为1:1；

所述内引物中SEQ ID No.3所示的DNA分子与SEQ ID No.4所示的DNA分子在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比为1:1。