[发明专利]一种基于SYBR Green I荧光定量的牦牛应激型HSPA1A基因组织表达谱建立

说明书

技术领域

本发明属于一种生物技术领域，具体涉及一种检测牦牛应激型HSPA1A基因组织表达分布的SYBR Green I荧光定量PCR方法及对应的组织表达谱的建立。该方法避免了设计、标记荧光探针和价格昂贵等问题，并且该方法检测灵敏度高，特异性强，重复性好，因此比采用其它方法来建立组织表达谱适用性更强。 

背景技术

热休克蛋白（Heat Shock Protiens，HSPs），也叫热激蛋白，广泛分布于真核生物和原核生物中，外界各种各样的应激源（比如高温、低温、缺氧、重金属等）能够诱导热休克蛋白的产生，从而使生物体免受应激因素的损害。HSP70家族是热休克蛋白家族中最重要的一员，同时也是生物体内高度保守的蛋白质家族之一。该家族成员众多，其中最常见的可以分为两类，一类是应激型的HSP70；另一类是结构型的HSC70（Heat Shock Cognate，热应激同源蛋白70），前者在正常细胞内表达量较低或者不表达，但是在热应激或者其他应激源的作用下，表达量迅速增加；后者在正常细胞内均有不同程度的表达，受到外界环境应激因素的影响表达量有不同程度的上升，应激型HSP70已成为现阶段研究的热点之一。HSP70对维持细胞内稳态，改善细胞的生存能力和减轻有害应激损伤有非常重要作用。 

HSP70在应激状态下帮助需要的蛋白质正确折叠，加快正常蛋白质合成的恢复；在细胞保护方面，HSP70表达的增加可以缓解细胞所受伤害，增强机体对应激的抵抗力；同时，HSP70在抗细胞凋亡、抗氧化和免疫反应中也起着重要作用。HSPA1A是HSP70应激型中的主要类型，对其研究能够更好地理解HSP70应激型在环境适应中的功能性。牦牛是生活在高原环境下的特有物种，与高原人民的生活息息相关。为了加强牦牛资源的保护和开发利用，以牦牛作为高原模式动物，应激型HSPA1A基因在牦牛各组织的表达谱的建立有助于更好地了解应激型HSPA1A基因在各组织的作用机理，有助于保护牦牛免受高原恶劣环境应激因素的影响，使其能够更加顺利地生产与繁殖。 

目前关于牦牛应激型HSPA1A基因组织表达谱建立还尚未见报告，本发明旨在建立一种基于SYBR Green I荧光定量方法的牦牛应激型HSPA1A基因组织表达谱，该表达谱的建立为进一步研究HSPA1A基因在牦牛的环境的适应性上提供基础。 

发明内容

本发明旨在建立一种基于SYBR Green I荧光定量方法的牦牛应激型HSPA1A基因组织表达谱的建立。该定量方法具有操作简便，检测灵敏度高，重复性好，污染少，PCR反应结束后，可立即观察结果，不需要电泳、染色等操作等优点，因此比采用其它方法来建立组织表达谱适用性更强。 

本发明的技术方案是通过如下步骤来实现的： 

1、牦牛各组织RNA的提取

分别提取3头公牦牛11种组织（心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、睾丸、脑），3头母牦牛12种组织（心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、卵巢、乳腺、脑）样品，称量约1g后迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。加入1 mL的Trizol，室温静置直至样品完全融化，吸取1 mL至无RNA酶的离心管中，加入200 μL的氯仿，剧烈振荡，室温静置5 min。4 ℃、12000 r/min离心15 min，小心吸取500 μL上清液，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min。4 ℃、12000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀加入1 mL 75 %的乙醇洗涤，4 ℃、12000 r/min离心5 min，弃上清，室温干燥沉淀，以30 μL DEPC水溶解RNA。

2、cDNA的反转录合成 

按照Fermentas公司的RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit反转录酶说明书，采用20 μL体系：oligo dT₁₈、1 μL，5×Reaction Bμffer、4 μL，Ribolock^TM Rnase Inhibitor(20 μ/μl)、1 μL，10 mM dNTP Mix、2 μL，RevertAid^TMM-MμLV Reverse Transcriptase(200 μ/μl)、1 μL，模板1 μL，最后用RNase Free dH₂O补足20 μL，按以下程序进行反转录反应：42 ℃、60 min；70 ℃、5 min。

3、引物设计