[发明专利]基于长探针同时检测多种微量靶标的方法

权利要求书

1.基于长探针同时检测多种靶标的方法，其特征在于包括以下特征：

1）、获取待检测的靶标及其内参18S rRNA的核酸序列，利用相关软件比对每种靶标的各个株系的核酸序列，获得每种靶标的保守区；再在每种待检测靶标及其内参18S rRNA的保守区设计紧密相连的两条寡核苷酸的鉴别探针，即上游鉴别探针和下游鉴别探针，所述上、下游鉴别探针是一对首尾相连并与各自的靶标序列互补的寡聚核苷酸，每种待检测的靶标及其内参18S rRNA分别设计两组上、下游鉴别探针；

2）、设计通用引物及选择填充物长序列，所述通用引物由上、下游通用引物组成，所述填充物、通用引物以及待检测的靶标序列均无同源性且不形成稳定空间结构的寡聚核苷酸；通用序列Tag2的3′与上游鉴别探针的5′相连组成上游LDR探针，填充物长序列与通用序列Tag1的5′端及下游鉴别探针的3′端相连组成下游LDR长探针；通用序列Tag1与下游通用引物互补，通用序列Tag2与上游通用引物相同；

3）、将上游LDR探针和下游LDR长探针与待检测的靶标样品一起进行连接酶检测反应，得到连接产物；

4）、利用上、下游通用引物扩增连接产物，通过琼脂糖核酸电泳获得条带信息，从而获知混合靶标的感染情况；

当出现与上述待检测靶标长度相同的条带时，被认定为感染了该待检测靶标；

反之，当没有出现任何条带时，被认定为没有感染待检测靶标。

2.根据权利要求1所述的基于长探针同时检测多种靶标的方法，其特征在于：

所述待检测的靶标为16kDa ^TRV、2b^CMV、P0^BWYV、HcPro^PVY、P25^PVX、P0^PLRV；

所述步骤4）为：

16kDa ^TRV连接产物扩增长度为204bp；2b^CMV连接产物扩增长度为312bp；P0^BWYV连接产物扩增长度为398bp；18S rRNA连接产物扩增长度为474bp；HcPro^PVY连接产物扩增长度为578bp；P25^PVX连接产物扩增长度为647bp；P0^PLRV连接产物扩增长度为793bp。

3.根据权利要求2所述的基于长探针同时检测多种靶标的方法，其特征在于：

所述上游通用引物为：5′>GGCATCGCATAACATAAGCA<3′，下游通用引物为：

5′>GTCCGTCCAACCGTCTG<3′；通用序列Tag1与下游通用引物互补，通用序列Tag2与上游通用引物相同。