[发明专利]番茄斑萎病毒的液相芯片检测引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒检测领域，具体涉及一种番茄斑萎病毒的液相芯片检测引物及检测方法。

背景技术

番茄斑萎病毒为布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的代表成员。自1915年在澳大利亚首次报道番茄斑萎病,并于1930年确定其病原为病毒后,许多国家相继有该病毒病发生和危害的报道。番茄斑萎病毒的寄主范围很广,包括温带、亚热带和热带的80多个科近千种双子叶和单子叶植物,可引起许多重要的园艺植物和农作物的严重病害,造成极其严重的经济损失。在美国,1971年在德克萨斯州的南部种植的花生上首次发现该病毒,至1984年其危害加重,1986年该地一个县的花生生产受到严重影响,损失近300万美元。在法国和西班牙等欧洲国家和地区,曾因该病毒的传播介体的大量扩散而引起番茄、辣椒等作物的严重病害,造成毁灭性损失,重病地块损失达100%。为防止该病毒在我国的传播扩散，该病毒被列入我国的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。目前在番茄斑萎病毒的检测上，较常用的方法有两种，一种是血清学检测方法，常见的有DAS-ELISA；另一种是分子生物学检测方法，其中以RT-PCR最为常见。

液相芯片检测技术是一种快速高通量检测技术，是对生物芯片技术的继承和发展，该技术集多种生化技术于一体，具有独特的优点：可通过不同荧光编码微球同时检测上百种不同的病原分子，满足高通量检测需要；相对于固相芯片，反应在液态体系中进行，可大大缩短检测时间；检测所需样本少（最少可至1μL）。该技术已用于李痘病毒（Plum pox virus,PPV）等植物病毒的检测，并有一些获得专利；到目前为止，国内外还未见应用该技术检测番茄环斑病毒的报道。

发明内容

本发明的目的是提供番茄斑萎病毒的液相芯片检测引物及检测方法，即一种操作简单、结果准确的番茄斑萎病毒液相芯片检测方法及其所用到的引物，从而弥补现有技术的不足。

本发明的一个目的是提供用于液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括引物组和探针，所述引物组由引物1和引物2组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1；

所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列2；

所述探针的序列为NH3-C12-T1，所述T1的核苷酸序列为序列表中序列3。

上述C12与所述T1的5’末端连接，C12为12个C原子；NH3-为氨基修饰。

上述试剂盒中，所述引物组的各条引物及所述探针均为独立包装。

本发明的另一个目的是提供用于液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒的引物组或探针。

本发明提供的所述引物组由引物1和引物2组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1；

所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列2；

本发明提供的所述探针的序列为NH3-C12-T1，所述T1的核苷酸序列为序列表中序列3。

上述的试剂盒或上述的引物组或探针中，所述引物2的5’末端标记生物素。

上述的引物组或探针在制备用于液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒的试剂盒中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第三个目的是提供用于液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或探针；所述试剂盒中的引物组的各条引物或所述探针均为独立包装。

上述的试剂盒或所述的引物组或探针在用液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒或用液相芯片检测或辅助检测待测样品中是否携带番茄斑萎病毒中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第四个目的是提供用液相芯片检测或辅助检测待测样品中是否携带番茄斑萎病毒的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）提取待测样品中的RNA作为模板，反转录得到cDNA；

2）生物素化的扩增产物和交联探针的微球的获得：

所述生物素化的扩增产物按照如下方法制备：以所述cDNA为模板，用上述的试剂盒中的引物组进行RT-PCR扩增，得到生物素化的扩增产物；