[发明专利]一种克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法

权利要求书

1.一种克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、基因组水平克隆

A1、提取梅花叶片中的DNA；

A2、引物的设计及PCR反应：设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计；设计的引物为：

上游引物P1：5′-GGAAAATATGGATCCRGA-3′

下游引物P2：5′-TCARTAGGGYAGGTGMTC-3′

用DNA为模板进行PCR操作扩增LFY同源基因，PCR反应体系为20ul体系：2μL10×EX Taq buffer，1.6μL dNTP(10mmol·L^-1)，0.2μL的Ex Tap酶，上下游引物各0.4μL，1μL的DNA，14.4μL的ddH₂O，反应条件为95℃预变性5min，30个循环：94℃，50s；58℃，50s；72℃，1min30s，最后72℃，10min；

A3、PCR产物的回收和纯化；

A4、克隆；

B、基因编码区全序列克隆

B1、提取梅花叶片中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；

B2、引物的设计及PCR反应：在基因组测序结果的基础上设计一对特异性引物，上下游引物分别包括起始密码子和终止密码子；设计的引物为：

上游引物Q1：5′-ATGGATCCAGACGCCTTCTC-3′

下游引物Q2：5′-TCAGTAGGGTAGGTGATCACTGC-3′

用cDNA为模板进行PCR操作扩增LFY同源基因，PCR反应体系为20ul体系：2μL10×EX Taq buffer，1.6μL dNTP：10mmol·L^-1，0.2μL的Ex Tap酶，上下游引物各0.4μL，1μL的DNA，14.4μL的ddH₂O.)，反应条件为95℃预变性5min，30个循环：94℃，50s；58℃，50s；72℃，1min30s，最后72℃10min；

B3、PCR产物的回收和纯化；

B4、克隆。

2.根据权利要求1所述的克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法，其特征在于，步骤A1中DNA的提取步骤为：

1)快速称取0.2g果梅幼叶于预冷灭过菌的研钵中，并加入少量PVP和2％β-巯基乙醇，加液氮研磨成粉状后立即加入600ul STE核分离缓冲液，迅速研磨成糊状匀浆，小心转入1.5mL离心管中，上下颠倒混匀，放置0℃冰浴10min；

2)取出，4℃下5000rpm离心10min，弃上清液，若上清液仍粘稠，用STE核分离液反复清洗后离心；

3)往沉淀中加入600ul65℃预热的3×CTAB核裂解液和10ulβ-巯基乙醇，同时洗净管盖及管壁上残留的植物组织，将材料轻轻混匀，65℃水浴保温60min，期间不时轻轻摇动离心管几次；

4)取出，冷却几分钟后加入600ul氯仿／异戊醇体积比24：1和“PCN”溶液0.0675g PVP，45ul10％CTAB+4％NaCl，摇匀，室温静置5min后10000rpm离心10min；

5)转上清液于一新的离心管，重复抽提2～3次，每次抽提时都加入“PCN”溶液去多糖；

6)取上清液，加入RNaseA至终浓度为10μg·mL^-1，37℃水浴保温30min，取出后加入1／5体积5mol·L^-1NaCl和2倍体积预冷的乙醇，颠倒摇匀，-20℃静置30min沉淀DNA；

7)挑出DNA集结成白色絮状用70％的乙醇清洗2次，室温风干后溶于50ulTE中，-20℃贮存备用。

3.根据权利要求1所述的克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法，其特征在于，步骤B1中所述RNA提取步骤为：

1)在10ml离心管中加入5ml CTAB和0.2ml的β-巯基乙醇，放入65℃水浴锅中预热；

2)在液氮预冷好的研钵中将样品磨细，磨样时加入适量的PVP，分装于预热好的离心管中，每管3药匙，涡旋仪上涡旋混匀1min，然后将离心管放入65℃水浴锅中加热，期间每个隔10min不时上下颠倒混匀，水浴持续30min；

3)再在混合物中加入3ml的酸性饱和酚：氯仿：异戊醇25：24：1，混合均匀后12000rpm，离心10min，常温；

4)吸取离心后的上清液3.5ml转入新的10ml离心管中，然后再加入3.5ml的氯仿：异戊醇24：1，上下颠倒混匀后12000rpm，4℃，离心10min；

5)重复第4)步，直至中间层消失；

6)第5)步完成后将上清分装入1.5ml离心管中，每管约0.7ml，然后加入等体积的预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后放入-20℃冰箱中冷冻30min；

7)将冷冻的离心管按4℃，14000rpm，离心10min要求进行离心，离心完成后将上面液体倒掉，保留离心管底部白色透明状的沉淀；

8)再加入适量的65℃预热好的SSTE溶解沉淀；

9)在溶解好沉淀的溶液里加入1ml的Trizol试剂，再加入0.25ml的氯仿，混匀后放置5-10min，12000rpm，4℃，离心10min；

10)转移上清液于新的离心管中，加入等体积遇冷的异丙醇，混匀后放置于冰上静置15min；

11)完成后4℃，12000rpm，离心15min收集沉淀；

12)收集到的沉淀中加入DEPC水处理的75％乙醇1ml，4℃，12000rpm，离心10min，倒去上清液，重复一次；

13)将液体倒掉，通风条件下晾干管中液体，加入30μlDEPC水溶解沉淀。