[发明专利]重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于工业化生产的重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法。

背景技术

红鳍东方鲀（Fugu rubripes）在我国主要分布于黄海、渤海和东海，是近海底层肉食性鱼类，其肉味鲜美，具有很高的食用价值，在红鳍东方鲀的生殖腺和肝脏等内脏中产生河豚毒素，其高活性和高特异性的生物特征具有潜在的医药开发价值，在临床上具有广阔的前景。干扰素(interferon，IFN)是一类在机体受到病毒感染，或受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等诱导时，由受体细胞分泌的、具有广谱抗病毒活性的蛋白质（主要是糖蛋白）。研究表明IFN通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，抑制病毒在宿主细胞中的复制。另外IFN还可增强自然杀伤细胞（NK细胞），巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，增强抗病毒能力，对细胞生长和细胞分化也有很重要的调节活性。然而，从红鳍东方鲀中直接提取该蛋白的操作复杂、成本高、产量少，不能大规模产业化生产。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于工业化生产的重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a.  提取新鲜红鳍东方鲀肾脏总RNA并反转录进行第一链的cDNA的合成；

b．以上述第一链的cDNA为模版进行RT-PCR扩增，扩增所用引物如下：

上游引物NcoⅠ：5’- CATGCCATGGGCTCCTACATCCCAGTAGAAATG-3’

下游引物XhoⅠ：5’-CCGCTCGAGATGACCTCGAATCGACATCT-3’

c．电泳回收RT-PCR产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，通过蓝白斑筛选阳性克隆，选择501大小的条带进行回收；

d．用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ分别双酶切c步骤所回收产物的质粒和表达载体pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α进行培养并筛选提取重组表达质粒；

e．将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）内，培养菌株得到菌种；

f. 将所收集的菌种进行扩大培养，经IPTG诱导后收集菌体；

g. 将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。

所述RT-PCR反应条件为：94℃预变性5分钟后进行94℃变性30秒、58℃复性30秒、72℃延伸30秒的30个循环的扩增，72℃延伸7分钟后保存于4℃。

所述e步骤是将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）后，挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的5ml LB液体培养基过夜培养，而得到菌种。

所述f步骤是将所收集的菌种按1：100的比例接种于Amp LB液体培养基，37℃200转/分摇菌2.5小时，至OD600为0.4，所摇菌液加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，37℃摇菌6小时，收集菌体。

所述g步骤是用磷酸盐缓冲液重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并将细菌裂解液12000转，4℃离心20分钟，得上情并将上清上样于层析柱，用平衡液洗涤后加入300mM的咪唑洗脱，收集洗脱液。

本发明设计了针对干扰素γ蛋白编码序列的引物，以TRIzol Reagent提取新鲜红鳍东方鲀肾脏总RNA后进行RT-PCR扩增，RT-PCR产物与pMD19T载体连接得重组质粒，经双酶切后目的基因再与表达载体pET-32a (+)连接，获重组表达质粒并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中；通过IPTG诱导实现了重组蛋白的可溶性表达。该表达质粒表达的融合蛋白带有组氨酸标签，将细胞破碎后取上清纯化，避免了样品的变性和复性，不但操作简单，降低了制作成本，更主要的是蛋白结构不受破坏；重组蛋白纯度好、得率高且不易降解，适应于工业化生产，为进一步研究红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的功能奠定基础。

附图说明

图1 本发明实施例红鳍东方鲀肾脏总RNA的琼脂糖凝胶电泳分析图。

图2 本发明实施例红鳍东方鲀干扰素γ蛋白目的基因的琼脂糖凝胶电泳分析图。