[发明专利]一种胶囊青霉及其分离培养方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种胶囊青霉及其分离培养方法与应用。

背景技术

青霉属大约包含300个种，多为腐生菌，存在于土壤中。该属菌种在食品工业和药品生产方面发挥重要作用。

在青霉菌中除了马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei）外，一般不引起人类疾病(参见文献Hu Y,Zhang J,Li X,Yang Y,Zhang Y,Ma J,Xi L.Penicillium marneffei infection:an emerging disease in mainland China.Mycopathologia.2013Feb;175(1-2):57-67.)。

目前，尚无从人类内脏组织中分离得到非马尔尼菲青霉菌，也没有对于非马尔尼菲青霉菌是否致病等进行分子和药敏鉴定的研究。

发明内容

本发明的目的在于分离得到一株新的可致病的非马尔尼菲青霉菌，本发明的另一目的是提供该菌株在筛选抗真菌药物中的应用。

本发明首次分离培养纯化一株新的可致人类真菌性肺炎的胶囊青霉（Penicillium capsulatum）菌株。

本发明的第一方面，是提供了一株胶囊青霉(Penicillium capsulatum)，已于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6020。

该菌株是于2011年长征医院一名56岁女性肺部占位中分离所得，组织病理可见大量菌丝存在，真菌培养菌株经核糖体基因ITS测序证实为胶囊青霉。

本发明的胶囊青霉(Penicillium capsulatum)菌株LWQ2011，CGMCC No.6020，属丝孢纲（hyphomycetes），青霉属（penicillium）。

1.形态特征：肺部占位用HE染色可见大量菌丝存在。

2.培养特征：组织在麦芽糖培养基（malt extract agar,MEA）25℃环境下培养7天可见灰绿色产孢菌落生成。MEA培养时，菌株在30℃和38℃环境下生长快于25℃。显微镜下可见单轮青霉分生孢子头，孢子光壁，椭圆形，大小3.5-4.5×2.5-3.0μm。

本发明对该菌株进行鉴定：采用胶囊青霉ITS1、5.8S rDNA和ITS2区扩增测序方法，具体为：合成以下真菌通用引物

上游引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(如SEQ ID NO:1所示)；

和下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(如SEQ ID NO:2所示)；

以基因组扩增，PCR反应体系50μL：10×PCR buffer5μL，2.5mmol/L dNTP混合物8μL，10umol/L引物各1μl，模板2μl，Taq酶0.5μl，无菌水32.5μL；

PCR扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，70℃延伸1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。

所得扩增产物由ABI3730DNA自动测序仪双向测序两次。序列如SEQ ID NO:3所示。将测序结果于NCBI网站进行序列比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），比对结果：与国外环境中分离的胶囊青霉菌株（NRRL2056）同源性99%。

本发明的第二方面，是提供了该菌株的培养方法。

挑取少许培养基上青霉菌落，将其分别接种于麦芽浸出培养基(MEA；Oxoid,Basingstoke,UK)、查氏培养基(Czapek yeast extract agar,CYA)培养基和酵母浸出膏葡萄糖琼脂培养基(yeast extract sucrose agar,YES)上，置于25℃、30℃和37℃温箱孵育，24小时后可见30℃、37℃孵育的培养基上有菌落长出，72小时后可见25℃孵育的培养基有菌落长出。菌落大体图见图2，培养微观图见图3。

所述的MEA培养基的组分和配方如下：麦芽浸出物10g、葡萄糖4g、琼脂15g，双蒸水1000ml，加200mg氯霉素，调节pH至6-7，121℃15分钟灭菌后备用；