[发明专利]一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞培养方法，尤其涉及一种宫颈上皮内瘤变细胞的培养方法。

背景技术

宫颈癌是世界范围内最常见的妇科恶性肿瘤，其发生是一个由癌前病变逐渐衍变为癌的过程，时间可以从数年到数十年。这种癌前变化代表了一系列组织学异常的宫颈上皮细胞，故又称为宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)。根据细胞异常的程度，CIN又进一步分为CINI(轻度不典型增生)，CINII(中度不典型增生)和CINIII(重度不典型增生和原位癌)。CINI在大多数情况下会自然消退，因此，事实上不属于癌前病变的范畴；但是CINII和CINIII往往持续存在，其中20％～45％未经治疗CINII／III会进一步发展成宫颈癌，因此，CINII和CINIII被认为是高级别病变和宫颈癌前病变。研究认为，几乎所有高级别CIN都是由致癌性人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)的持续感染引起的，而长期的病毒感染是CIN进一步发展的必要条件，但是，病毒没有自己独立的代谢系统，必须寄生在宿主细胞中才能繁殖，因此，HPV不能在进行细胞外培养。在CIN生物学特性的体内外研究中，培养自然HPV感染的CIN细胞具有重要意义。

由于技术和方法的问题，人CIN细胞的体外培养及特性等研究仍然很不成熟，特别是标本的大小问题。宫颈发生瘤变的组织往往较小，进行分离后很难得到足够的CIN细胞进行培养。到目前为止，只有两篇文献对CIN细胞的分离及培养方法进行了描述。其中一项研究中采用的是“组织块培养法”，对整块病变组织进行显微镜下分割后转入培养瓶中进行培养，收集从组织块中长出的角质细胞并接种到灭活的小鼠成纤维细胞滋养层上。该种方法的主要缺点在于经过辐射处理的小鼠滋养层细胞有病毒感染等潜在风险。此外，角质细胞收集的数量较少，且容易在培养中被快速生长的成纤维细胞所污染。另一项研究中，将CIN组织用II型胶原酶消化后接种到含有10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的DMEM-F12培养基中，与成纤维细胞共同培养。该培养方法的缺点在于培养方法相对复杂，培养过程中需剪除培养瓶上层，增加污染的风险，同时所需时间较长，需要五周传代。此外，培养基中的FBS增加了成纤维细胞污染的风险以及角质细胞的分化。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种成活率及纯度高且传代后细胞生物学特性无明显改变(即细胞无明显分化)，携带HPV的宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法，包括以下步骤：

步骤一，取小块人宫颈瘤变组织，小部分进行HPV分型检测，部分进行培养；

步骤二，用I型胶原酶消化分解后制成细胞悬液；

步骤三，利用台盼蓝拒染法对细胞的活性进行判定；

步骤四，将细胞悬液接种到低胎牛血清培养基且经鼠尾胶原包被的培养瓶中，等待细胞贴壁；

步骤五，细胞贴壁后更换无血清培养基对宫颈上皮内瘤变细胞进行纯化，每周更换至少两次培养液，待细胞融合至80％～85％后传代。

步骤六，通过免疫荧光检测对细胞进行鉴定，通过PCR对HPV进行分型检测。

作为一种优选的技术方案，在上述步骤一中，用3％～5％醋酸和卢格氏碘溶液标记病变组织，在阴道镜引导下活检钳钳取宫颈上皮内瘤变组织约2～3mm³，在甲硝唑液体中浸泡4～6分钟，将宫颈上皮内瘤变组织取出后置于转移培养基中3℃～5℃低温保存。

作为一种优选的技术方案，所述转移培养基含有2000U／ml青霉素、2000ug／ml链霉素和5ug／ml两性霉素。

作为一种优选的技术方案，在上述步骤二中，取出宫颈上皮内瘤变组织放入陪替氏培养基中；在无菌条件下，将宫颈上皮内瘤变组织用含有青霉素、链霉素和两性霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2～4次；

将宫颈上皮内瘤变组织剪碎，加入预热至36℃～38℃的I型胶原酶，然后将其移入无菌离心管中，用I型胶原酶冲洗陪替氏培养基并将冲洗液加入同一离心试管中；将离心试管放在置于电热恒温振荡器中，慢慢搅动25～35min，用吸液管吹打离散1～3min；

然后用吸液管吸取含有单个细胞的液体，用200目筛网过滤至无菌离心管中；用PBS冲洗离心管后将冲洗液过滤至同一离心管中；将含有单细胞悬液的离心管放置台式离心机上，以1000r／min离心4～6min；