[发明专利]一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种石蜡切片的制作方法，尤其涉及一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法。

背景技术

芍药（Paeonia lactiflora）为芍药科芍药属多年生宿根花卉，是中国的传统名花，栽培历史悠久，与牡丹并称“花中二绝”，是植物造景和切花的优良材料，观赏价值极高。

在长期的系统演化过程中，芍药种子形成了特殊的休眠萌发特性，即上、下胚轴休眠特性。种子繁殖是获得芍药实生苗的唯一手段，是无性繁殖的基础。自然条件下从播种到出苗需要6～7个月的时间，生长周期长，对芍药的人工栽培生产和种子检验带来很大的困难。探讨这种特殊的双重休眠机理机制，在学术上和解决生产实践中遇到的问题均具有重要意义。胚是种子萌发的主体，而对芍药种子胚萌发的研究少见报道。

石蜡切片是组织学研究中的重要实验技术，其基本步骤包括样品的取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、脱蜡、染色和封片等一系列特殊处理。整个过程虽然并不复杂，但要制出高质量的切片，每一个步骤的操作都很重要，且具有不同组织结构的植物以及植物不同部位的组织结构所需的处理不同，需要进行摸索和改进。而芍药成熟种胚石蜡切片技术方面的相关研究报道很少。

综上所述，如果能找到芍药成熟种胚石蜡切片的制备方法，能为研究芍药种子休眠和萌发提供准确的技术支持，对揭示芍药种子休眠机理具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对芍药种子胚乳多、浸蜡难和种胚小、难操作的问题，找到一种操作简单方便的芍药成熟种胚石蜡切片的制备方法，使制作的切片组织结构完整、清晰，易于观察。

本发明的技术方案如下：

1、取材和固定：

（1）洗种子：用洗洁精清洗10～20min，流水冲洗干净。

（2）种子的筛选：水选，浸种2～3h之后，去除上浮的不充实种子。

（3）用浓度0.5%的高锰酸钾溶液对芍药种子进行40min消毒处理，用蒸馏水冲洗干净。

（4）在恒温箱中，45℃温水浸种48h，使种皮软化，种子吸水。

（5）去除上浮的不充实种子。

（6）用吸水纸吸干种子表面的水分，用手术刀剥去种皮，将芍药种子切割成含有胚的种尖部分（四周含部分胚乳）迅速放入盛FAA固定液（福尔马林、冰醋酸和浓度70%乙醇的体积比为1：1：18）的青霉素药瓶中固定，4℃冰箱放置，固定24h以上。

2、脱水：将固定好的材料放入浓度70%的乙醇中泡洗3～5次，先后转入浓度70%乙醇、浓度80%乙醇、浓度90%乙醇、浓度95%乙醇进行梯度脱水，各梯度间隔时间为1.5h。之后无水乙醇浸泡1h，然后更换无水乙醇再浸泡1h，对材料彻底脱水。

3、透明：脱水后的芍药成熟种胚依次放入体积比为2:1的无水乙醇和二甲苯混合液、体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液、体积比为1:2的无水乙醇和二甲苯混合液浸泡，各级浸泡透明2h，然后更换纯二甲苯浸泡1h，再次更换纯二甲苯浸泡30min。

4、浸蜡和包埋：透明处理后将青霉素瓶中的二甲苯倒出1/2，向瓶中添加蜡屑（熔点为52～54℃和62～64℃的混合蜡屑，两者体积比1:1）直到饱和，放回恒温箱中，40℃过夜，青霉素瓶盖儿漏缝盖，让二甲苯慢慢蒸发。第二天早上，再向小瓶中加1/5药瓶体积的蜡屑，敞口放置于60℃恒温箱中，2h后把原溶液倾去，换熔融石蜡（熔点为52～54℃和62～64℃的混合蜡屑，两者体积比1:1），之后每2h换一次蜡液，每天3次，重复5天后进行常规石蜡包埋。

5、切片：根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片，采用旋转式手动切片机，切片厚度7～10μm。

6、展片及粘片：粘片剂采用明胶粘片剂（1g明胶溶于100ml蒸馏水中）。在洁净的载玻片上均匀涂上少许明胶，将蜡带光面小心地放在载玻片上，以水作漂浮剂，在50℃恒温水浴锅的铁板上使蜡带展平，之后自然干燥。