[发明专利]一种双光子荧光探针及其制备方法和用途

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种双光子荧光探针、其制备方法及其用途，可以通过双光子成像定性检测细胞中半胱氨酸或高半胱氨酸。

二、背景技术

氨基酸比如半胱氨酸、高半胱氨酸以及谷胱甘肽在生物系统中发挥着重要的作用。他们有着相同的结构式，当这些氨基酸的浓度达到一定程度时，会导致一系列的疾病，比如增长放缓、头发褪色、水肿、嗜睡、肝损伤、肌肉和脂肪减少、皮肤病变和阿尔茨海默氏症。如何检测他们是非常重要的并且引起很多科学家的兴趣。然而定性地在细胞中检测氨基酸分子还是很少，因此在体内外检测氨基酸小分子尤为重要。

荧光探针是在一定体系内，当一种物质或体系中某一物质性质发生变化时，荧光信号能发生相应改变的分子。荧光光谱由于其检测方便，灵敏等优点在痕量检测中展现了优越的性能。

喹啉具有良好的光谱特性和水溶性，并且对细胞也是低毒性。因此喹啉是一个很好的荧光报告基团。喹啉作为荧光团已报道的文献很多，但大部分局限于单光子荧光探针，双光子荧光探针报道甚少。荧光探针对半胱氨酸/高半胱氨酸检测的双光子荧光探针更为稀少。

目前半胱氨酸/高半胱氨酸检测荧光探针大部分为单光子荧光探针，然而单光子荧光探针不仅易使生物本体产生自发荧光干扰，而且短的激发波长还会对细胞产生光致毒。近几年来，双光子荧光探针作为一个科学家感兴趣的研究课题，开始逐步替换单光子荧光探针，双光子荧光探针具有近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率、降低生物组织吸收系数及降低组织自发荧光干扰等优点。

三、发明内容

本发明旨在提供一种双光子荧光探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计遴选合适的荧光探针结构，以实现双光子成像定性检测细胞中半胱氨酸或高半胱氨酸，具有选择性专一、灵敏度高、检测浓度低的优点，细胞毒性测试表明本发明对细胞几乎没有毒性作用。

本发明双光子荧光探针，是以喹啉为母体，简称荧光探针或荧光探针分子（NQ），其结构由下式表示：

本发明双光子荧光探针的制备方法，按以下步骤操作：

（1）将对碘苯胺15g(68.49mmol)和6mol/L的盐酸100mL加入反应器中，升温至105℃，待固体完全溶解后向反应器中滴加巴豆醛12g(171mmol)，保温反应并用TLC跟踪至原料反应完毕，反应结束后冷却至室温，反应液倒入200mL水中，用乙酸乙酯萃取以除掉未反应的巴豆醛，水相用氨水中和至pH值为8，再用乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥并旋蒸后得到粗产物，重结晶（溶剂为乙酸乙酯和石油醚按体积比1:20构成的混合溶剂）后得到中间体1；

（2）将中间体18g(29.74mmol)加入圆底烧瓶中，加入1,4-二氧六环溶解，随后加热至60℃，每隔十分钟加一次二氧化硒0.82g(7.43mmol)，二氧化硒的加入总量是4.95g，升温至80℃反应2.5小时，反应结束后冷却至室温，过滤并用1,4-二氧六环洗涤，收集有机相，旋蒸后得到粗产物，粗产物用柱层析分离提纯（二氯甲烷作为洗脱剂）得到中间体2；

（3）将中间体24g(14.13mmol)、4-（N,N-二甲基）苯乙炔2.08g(14.13mmol)、三苯基磷二氯化钯0.1g(0.14mmol)、碘化亚铜0.5g（2.6mmol）以及三乙胺10mL加入圆底烧瓶中，加入甲苯溶解，室温反应8小时，过滤后收集滤液，将滤液旋蒸后得到粗产物，重结晶（溶剂为乙酸乙酯和石油醚按体积比1:5构成的混合溶剂）后得到双光子荧光探针NQ。

本发明荧光探针分子NQ的合成过程如下：

本发明双光子荧光探针在定性检测细胞中半胱氨酸或高半胱氨酸时作为检测试剂的应用。

将本发明荧光探针分子溶于DMSO中制得1mM的母液，取250μL的该母液于10mL容量瓶中，再用DMSO定容，配制成25μM。同样方法取250μL的母液于10mL容量瓶中，然后加入5倍当量的半胱氨酸（Cys）或高半胱氨酸（Hcy）。荧光探针单光子和双光子的激发波长分别为395nm和800nm，检测485-700nm范围内的荧光光谱变化，随着时间的变化，550nm发射峰逐渐增强（图3）。