[发明专利]生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法

权利要求书

1.生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法，其特征在于，用荧光蛋白表达载体转染五指山猪体细胞，生产表达红色荧光蛋白的转基因五指山猪。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：

获得可转染的五指山猪体细胞；

用抗性荧光蛋白表达载体转染上述五指山猪体细胞；

筛选能够稳定表达荧光蛋白的转基因体细胞；

用上述转基因体细胞作为供体，去核的体外培养成熟的猪卵母细胞作为受体，采用体细胞核移植的方法获得转基因五指山猪重构胚胎；

将上述重构胚胎进行体外培养后，移植到代孕的大白猪体内，上述猪分娩后，得到表达荧光蛋白的转基因五指山猪。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光蛋白表达载体为红色荧光蛋白表达载体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述红色荧光蛋白表达载体为单体红色荧光蛋白表达载体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述单体红色荧光蛋白表达载体包含有磷酸激酶启动子的新霉素抗性基因片段。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转染的方法为Nucleofector TM转染法，其条件为：所述五指山猪体细胞的个数为：2×10⁶,红色荧光蛋白表达载体的添加量为：2ug，转染程序为：U-023电转。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述转染之后，所述筛选能够稳定表达红色荧光蛋白的转基因体细胞之前，还包括下列步骤：

对转染的效率进行评价；

所述筛选能够稳定表达红色荧光蛋白的转基因体细胞的步骤具体为：选择转染效率最高的五指山猪体细胞筛选能够稳定表达红色荧光蛋白的转基因体细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述对转染的效率进行评价的方法具体为：将转染细胞放在激发波长为520～550nm荧光显微镜下观察红色荧光的表达，以放大200倍显微镜视野为标准，转染4次，统计5个显微镜视野表达红色荧光细胞数，计算其占转染细胞数的比率，以此比率评价转染的效率。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述五指山猪体细胞为五指山猪的耳成纤维细胞。

10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述筛选能够稳定表达荧光蛋白的转基因体细胞为用选择性培养基连续筛选15d。