[发明专利]一种活体提取缢蛏DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及提取生物DNA的方法，特别涉及一种活体提取缢蛏DNA的方法。

背景技术

缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck)为我国重要滩涂贝类，是四大海产养殖贝类之一。据统计，我国贝类养殖产量占海水养殖总产量的82%。滩涂贝类年产量近200万吨，其中缢蛏产量达70万吨，约占我国滩涂贝类养殖总产量的30%。虽然我国缢蛏养殖有800多年的历史，但是苗种都是来自于野生种，培育生长速度快、经济性状良好的优良品种是保障缢蛏养殖业持续发展的重要途径。

但是单独进行传统的选择育种，其选育周期较长，而且其表型性状容易受到环境的影响，因此借助分子标记辅助育种的技术手段，在基因水平上筛选与生长性状相关的分子标记，从而可以加快育种速度和准确度。尤其是在微卫星及SNP标记的开发中，检测缢蛏基因型是进行缢蛏生长性状与分子标记关联分析的关键。而缢蛏DNA的提取是必不可少的环节，传统提取DNA的方法需要处死缢蛏，获取其外套膜。这对其生长性状的检测以及接下来的种质利用造成极大的影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对现有传统缢蛏DNA提取方法所存在的问题而提供一种既能获取DNA又无需杀死缢蛏活体提取缢蛏DNA的方法，在缢蛏育种中具有重要的应用价值。

本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：

一种活体提取缢蛏DNA的方法，包括如下步骤：

1）缢蛏出水管组织的剥离：

1.1）把待取组织的缢蛏放入水温20-30℃的海水培养桶内暂养，并在缢蛏外壳粘上带号码的标记；

1.2）需要提取DNA时，将待取组织的缢蛏放置在冰上，麻醉待其出水管伸出后用剪刀剪取缢蛏出水管，长度为0.3-1.0cm，放入相应的第一离心管并记好编号；

2）出水管组织基因组DNA的提取：

往收集在离心管中的出水管组织中加入DNA提取液，涡旋离心15-30s，加入DNA提取液1/10倍体积的l20mg/ml蛋白酶K，震荡混匀，在56℃放置，直至组织完全溶解得到第一溶液；

3）向第一溶液中加入DNA提取液1.0-1.2倍体积的苯酚溶液翻转使其充分混匀的第二溶液；将所得的第二溶液放入离心机以10000-12000rpm离心10min-20min得到第一上清液，将第一上清液转移到第二离心管；

4）加入等体积的氯仿/异丙醇混合溶液，充分混匀后放入离心机10000-12000rpm离心10min-20min得到第二上清液；所述氯仿/异丙醇混合溶液中氯仿与异丙醇的体积比为24:1；之后向第二上清液中加入两倍体积的-20℃无水乙醇；以10000-12000rpm离心10-15min后用75%乙醇洗涤2次，倒掉离心管中液体，室温晾干得到晾干物；加入40-120μl无菌水，4℃冰箱内过夜溶解。

5)提取DNA的检测：

用1.0%的琼脂糖凝胶检测DNA片段大小，DNA大分子条带清晰。

分光光度计显示所得DNA的浓度在50-3000ng/μl，OD260/OD280在1.7-1.9。

在本发明的一个优选实施例中，所述步骤1）的海水培养桶是指圆形塑料桶，内加比重为1.015的海水，底下铺泥，泥的颗粒直径Φ<150μm，厚度5-10cm。

由于采用了如上的技术方案，本发明的方法与现有技术相比，具有如下显著的技术效果：

1.采用本发明方法是从缢蛏能够再生的出水管组织中提取DNA,从而避免杀死缢蛏或者影响缢蛏的生长发育。

2.采用本发明方法提取缢蛏的DNA可以检测其基因型，在缢蛏科研和育种中具有重要的应用价值。在家系培育中，亲本十分珍贵，对亲本的伤害影响其生产性能的考察和种质利用。

3.采用本发明方法可以检测家系亲本的基因型，从而预测子代的生产性能，筛选家系，提高缢蛏育种效率。

附图说明

图1为缢蛏DNA1.0%琼脂糖电泳图片示意图。

图2为缢蛏DNA1.0%琼脂糖电泳跑胶结果示意图。

图3为剪去出水管后的缢蛏存活率示意图。

具体实施方式

实施例1：

为了证实从同一个个体外套膜和出水管中提取的DNA是一样的，该实施例1采用1对普通引物分别对5个缢蛏的外套膜和出水管中提取的DNA进行PCR检测。

1.缢蛏外套膜和出水管的获取