[发明专利]一种肺癌患者血清特异性代谢产物谱及其建立方法

权利要求书

1.一种基于肺癌患者血清的液相/气相色谱质谱联用代谢组学分析方法，包括：

（1）样品制备：收集临床病人与正常人的血清样本，经处理去除蛋白质等大分子后准备进行色谱检测分析；

（2）液相色谱质谱和气相色谱质谱分析测定：采用基于液相色谱质谱和气相色谱质谱的方法得到血清中的代谢物谱，并对代谢谱进行分析； 

（3）模式识别分析血清中代谢物谱：上述数据采用多变量数据统计软件建立数学模型，对步骤(2) 中产生的代谢物谱进行分析，比较正常人与肺癌患者代谢物谱的差异，从而确定特异性代谢物谱。

2.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中的处理包括样本经过甲醇蛋白沉淀。

3.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(2)中代谢物谱经过处理得到原始数据，所述原始数据优选地是各个峰的峰高或者峰面积以及质量数和保留时间等数据。

4.根据权利要求4所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对原始数据进行峰检测和峰匹配，优选地采用R软件平台下采用自写的程序代码进行所述峰检测和峰匹配。

5.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(3)中的多变量数据统计软件Simca-P11.0，选用主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘方分析(OPLS)等方法建立数学模型，比较正常人与肺癌患者手术前后代谢物谱的差异，从而确定特异性代谢物谱。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中的样本收集具体为：收集健康正常体检者和肺癌患者手术前及术后7天空腹血标本各5 mL于无菌促凝BD真空采血管中，2500 rpm，4℃离心5 min，取上层血清，保存于-80 ℃冰箱中待用。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中进行液相色谱质谱测定样本的处理为：将低温保存的血清样本置室温解冻摇匀，取100 μL的样本加入300 μL甲醇，涡漩震荡30 s，4 ℃静置20 min；所有样本进行冷冻离心（12000 rpm，4 ℃，15 min），取200 μL上清液，转入进样小瓶备用。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中进行气相色谱质谱测定样本的处理为：将低温保存的血清样本置室温解冻摇匀，取100 μL的样本加入300 μL甲醇，涡漩震荡30 s，4 ℃静置20 min；所有样本进行冷冻离心(12000 rpm，4 ℃，15 min)，取150 μL上清液，转入玻璃衍生小瓶，加入10 μL的内标溶液（二氯苯丙氨酸，浓度为0.02 mg/mL），置温和氮气下吹干4 ℃；向玻璃衍生小瓶中加入30 μL的20 mg/mL甲氧胺盐酸吡啶溶液，强烈震荡30 s，于37 ℃肟化反应90 min；取出后加入30 μL的BSTFA（含1%TMCS）的衍生试剂，于70 ℃反应60 min，取出样本，室温放置30 min，转入进样小瓶备用。

9.根据权利要求1-5中任一项所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相色谱-质谱条件为：Agilent C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm），流速0.4 mL/min，柱温为40 ℃，流动相A：0.1%甲酸-水，B：0.1%甲酸-乙腈，进样量为4 μL，自动进样器温度4 ℃；ESI 离子源，采用正离子扫描模式，以氮气作为雾化、锥孔气；毛细管电压4 kV、锥孔电压35 kV、离子源温度100 ℃；脱溶剂气温度350 ℃、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气600 L/h、萃取锥孔4 V；离子扫描时间0.03 s，扫描时间间隔0.02 s，数据采集范围：50-1000 m/z。