[发明专利]发酵生产9-OH-AD的耻垢分枝杆菌、菌剂、制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产甾体激素的菌株和制备方法，具体是一种发酵生产9-OH-AD的耻垢分枝杆菌、菌剂、制备方法和应用。 

背景技术

近代，有关使用微生物法转化植物甾醇制备甾体中间体的研究成果被广泛报道和研究，相关报道最早可追溯到1937年，Mamoli和Vercellone发表的两篇专利Ber.70470和Ber.70,2079，在专利中，他们针对使用酵母菌将17-羰基还原为17-β-羟基进行了阐述。此后，peterson和Murray在US Pat.No.2602769中阐述了黄体酮11位α羟基化。1972年，Kraychy等在US Pat.No.3684657阐述了用Mycobacterium SP.NRRL B-3683降解17位脂肪链制备4-AD,ADD的方法。1973年，Marsheck等在专利US Pat.No.3759791中阐述了用 

Mycobacterium SP.NRRL B-3805,以胆甾烷等17位有8个以上碳原子的甾体原料制备4-AD。 

9-OH-AD是制备可的松的重要中间体，迄今为止，有很多文献报道了9-OH-17-羰基相关甾体特别是9-OH-AD的制备方法，US patent4397947报道了用诺卡氏菌转化4-AD到9-OH-AD的方法，EP-A-0027829报道了用Corynespora cassicola菌转化4-AD到9-OH-AD的方法。1977年Merle G.等在US Pat.No.40352236中阐述了由植物甾醇制备9-OH-AD的过程。US patent3759791报道了使用分支杆菌，以甾醇为底物制备9-OH-AD的方法。1988年，专利GB2197869报道了由Mycobacterium roseum，以甾醇为底物制备9-OH-AD的方法，重量收率28.5%，1986年，EP0322081B1中，Slijkhuls等阐述了使用菌种Mycobacterium species CBS482.86将甾醇转化9-OH-AD的实例，其投料量约1.3%(90%含量)，转化216小时，HPLC重量收率42.1%。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种发酵植物甾醇生产9-OH-AD的耻垢分枝杆菌，菌剂，制备方法和应用，本发明生产9-OH-AD的重量收率高，发酵效率高。 

本发明所使用底物为植物甾醇，菌株为耻垢分枝杆菌NK-XHX-118（Mycobacterium smegmatis NK-XHX-118），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2013544。 

上述耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）CCTCC NO：M2013544通过自行采集得到的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）CD116诱变培育得到。 

诱变过程如下： 

1、原始菌株为耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）CD116，该菌株能够降解植 物甾醇，于堆积植物甾醇场地附近的土壤中筛选得到。 

将原始菌株在30℃培养，180rpm培养，培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化钠0.5%，酵母膏0.1%，丙酸钠0.05%，pH值用10%氢氧化钠溶液调至7.0，121℃灭菌30分钟。 

当菌体密度生长至5×108个/ml，离心，菌体用pH=5.6，0.1mol/L无菌柠檬酸钠溶液冲洗，并用柠檬钠溶液将菌体稀释到原来的体积，再加入亚硝基胍，亚硝基胍浓度：60μg/ml，菌悬液于37℃水浴半小时，再次离心，菌体用等量的0.1mol/L，pH=7的磷酸缓冲液冲洗。最后，菌体重新在0.1mol/L，pH=7的磷酸缓冲液中悬浮分散，得诱变后的菌悬液。 

2、菌株筛选 

初筛培养基：葡萄糖1%,磷酸氢二钠0.4%，磷酸二氢钾0.4%，七水硫酸镁0.03%，七水硫酸亚铁0.005%，琼脂2%，pH=7.5，培养基121℃灭30min。 

复筛培养基：9-OH-AD0.2%,磷酸氢二钠0.4%，磷酸二氢钾0.4%，七水硫酸镁0.03%，七水硫酸亚铁0.005%，琼脂2%，pH=7.5。培养基121℃灭30min。 

将诱变后的菌悬液进行稀释涂布，培养基采用初筛培养基，于30℃培养7天。挑取单菌落接种到复筛培养基中，凡是在复筛培养基中不能生长的菌体，用初筛培养基进行进一步的培养纯化，得到诱变后的菌株。