[发明专利]抗肿瘤多肽和透明质酸酶药物组合物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用基因调控制备抗肿瘤多肽和透明质酸酶组合物及其制备方法，属于基因工程领域。具体涉及抗肿瘤多肽LRR5组成型表达载体及人透明质酸酶rhPH-20诱导型表达载体的构建，包含抗肿瘤多肽及人透明质酸酶的重组毕赤酵母的构建；还涉及重组酵母发酵生产抗肿瘤多肽与透明质酸酶组合物过程中，通过诱导剂甲醇添加时间调控抗肿瘤多肽与透明质酸酶表达量比例的方法。

背景技术

目前对肿瘤患者常见的化疗和放疗手段往往导致严重的副作用，因此寻找高效、低毒的抗肿瘤药物是目前的重要研究方向。在实体肿瘤组织中，新生血管是维持肿瘤细胞新陈代谢的重要保障，是肿瘤生长和转移不可缺少的条件之一。肿瘤新生血管生成过程依赖于血管内皮细胞（VEC）增殖、移行、黏附和侵入细胞外基质（ECM）等几个阶段。由于内皮细胞较其它细胞更易接触到血管内的药物，且具有遗传稳定性和不易突变为耐药的突变体等特点，抑制内皮细胞生长、增殖和转移的多肽类药物成为最有效的抗肿瘤药物之一。来自于蛋白聚糖结构中的一段富亮氨酸重复序列5（LRR5）被证实是一种抗肿瘤多肽，属于血管新生抑制因子。它可以抑制由血管内皮生长因子（VEGF）诱导的内皮细胞迁移、在基质胶上的血管生成及与胞外基质中纤维连接蛋白的接触，还可以诱导内皮细胞凋亡，最终达到抗肿瘤的目的。LRR5序列中的不同部分具有不同的抗肿瘤机制，中间区域的12个氨基酸（LRR5M）抑制内皮细胞血管生成的作用是LRR5的上千倍；碳端的氨基酸（LRR5C）能有效抑制VEGF诱导的内皮细胞迁移；而氮端的氨基酸序列（LRR5N）主要用于阻止内皮细胞与纤维蛋白接触。另外，LRR5M和LRR5N均具有诱导内皮细胞凋亡的作用。

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是由(1-3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-(1-4)-O-β-D-葡糖醛酸双糖重复单位组成的直链非硫酸化多聚糖，是细胞外基质的重要组成部分。众多研究表明，在肿瘤浸润区及转移过程中，通常会伴随HA水平显著升高。例如在结肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌、静脉平滑肌瘤及淋巴瘤中，HA的水平均有所升高，并且在结肠癌的恶性病变过程中伴随着HA表达量的增加。肿瘤发生时，HA可以通过多种方式促进肿瘤的浸润和转移，它的大量存在使得抗肿瘤药物难于接近细胞，不利于肿瘤的治疗。透明质酸酶（hyaluronidase，HAase）是能使HA产生低分子化作用酶的总称，又被称为玻璃酸酶。在临床治疗中，透明质酸酶通过对HA的解聚作用，能加速物质的扩散和吸收，提高局麻效果，并且能防止皮下及肌肉注射后组织的破坏。美国FDA已批准其单剂量小包装注射用绵羊透明质酸酶（Vitrase）无菌液作为分散剂，可用于促进其它药物分散和吸收。

因此，在肿瘤的治疗过程中，将抗肿瘤多肽与透明质酸酶合用，可通过后者对细胞外基质的降解，使药物易于接近肿瘤并被其摄取，从而提高肿瘤对药物的敏感性。另外，由于在蛋白质表达方面，毕赤酵母（Pichia pastoris）具有大肠杆菌、酿酒酵母菌表达系统所不可比拟的优点，采用重组毕赤酵母制备抗肿瘤多肽与透明质酸酶的组合物，可实现抗肿瘤药物的大规模生产，简化产物的制备和纯化工艺，降低药物生产成本。同时，在重组酵母发酵过程中采用基因调控手段控制组合物中透明质酸酶的表达量，有利于提高抗肿瘤药物的有效性和安全性。

发明内容

本发明的目的之一在于为了克服抗肿瘤多肽药物在肿瘤部位的难吸收问题，而提供一种抗肿瘤多肽与透明质酸酶组合的产品。

本发明的目的之二在于为了克服抗肿瘤多肽与透明质酸酶提取与制备的低纯度、高成本问题，而提供一种能制备抗肿瘤多肽与透明质酸酶的组合物的毕赤酵母基因工程菌株。

本发明的目的之三在于为了避免组合物中透明质酸酶过量引起的潜在副作用问题，而提供一种利用诱导物添加时间来控制组合物中透明质酸酶表达量的基因调控方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：首先构建一种用于表达抗肿瘤多肽的组成型表达载体及一种用于表达透明质酸酶的诱导型表达载体；然后将两个载体依次导入宿主体内得到一种用于制备抗肿瘤多肽和透明质酸酶组合物的基因工程菌株；在重组菌株发酵过程中抗肿瘤多肽为组成型表达，而透明质酸酶的表达量由诱导剂的添加时间控制。