[发明专利]一种结合荧光定量PCR技术的焦磷酸测序方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种结合荧光定量PCR技术的焦磷酸测序方法，属于生物技术领域。

背景技术

测序技术是序列分析和突变位点检测的“金标准”，通过测序可直观的得到靶标的核酸序列，为遗传性疾病相关位点发现、耐药位点分析等提供便利。核酸序列也是病原微生物分型的基础，乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）等病原微生物的亚型区分都是基于病毒的全基因组序列差异或部分区域的序列差异。

近年来，已有一些测序产品和解决方案用于临床诊断领域，包括病毒亚型分析、用药位点筛查、遗传疾病监测等。与传统的Sanger测序技术相比，焦磷酸测序技术更适合在临床大规模运用。主要在于：

（1）焦磷酸测序整个流程步骤少，操作简便，且为实时检测，即测序和检测是同步进行，免去测序产物纯化步骤，因此耗时少，检测过程仅需10分钟左右，对于一个检测项目而言，从样本处理至获得测序结果，只需要6小时左右，基本当天即可出报告，非常适合临床使用，而传统的Sanger测序需要1.5-2个工作日左右；

（2）焦磷酸测序的灵敏度可至5%，若结合一些突变富集技术，可至1%甚至更低，而传统的Sanger测序的灵敏度只有15-20%左右；

（3）焦磷酸测序可进行定量，即给出杂合子中不同基因型的比例，而传统的Sanger测序不能做到这点；

（4）焦磷酸测序结果为软件自动判断，而传统的Sanger测序需人工分析突变位点。

但无论传统的Sanger测序还是优势更为明显的焦磷酸测序，都是基于普通PCR，对于临床检测，还存在一定的弊端，这些弊端包括：

（1）耗时长：PCR-电泳检测PCR产物，一般需要2-3个小时；

（2）易污染：电泳、PCR产物纯化（一般为切胶回收）等过程，均耗时长，易产生大量PCR产物气溶胶，引起假阳性；

（3）易漏检：电泳检测灵敏度低，易造成漏检；

（4）易损失：PCR产物纯化过程中将损失一部分，影响低浓度模板的检测效果；

（5）难定量：PCR产物的量通过电泳只能粗略估计，产物过多将使测序引物过快消耗，影响检测效果，与此同时，临床上有些项目是有定量要求的，如乙型肝炎病毒定量检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种结合荧光定量PCR技术的焦磷酸测序方法，本发明一方面克服了焦磷酸测序的现有弊端，提供一种适于临床诊断领域的焦磷酸测序使用方法，另一方面提供基于上述方法在制备基因检测试剂盒中的应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种结合荧光定量PCR技术的焦磷酸测序方法，包括：

1）荧光定量PCR：使用特异性的引物和带荧光标记的探针，对靶标所在核酸片段进行扩增，并通过实时荧光定量PCR仪予以实时检测，最后获得靶标的定量结果和PCR产物；

2）制备PCR产物单链模板：将PCR产物固定于链霉亲和素琼脂糖HP珠子上，并制备成单链状态；

3）测序反应及检测：使用特异性的测序引物，在预先设置好的焦磷酸测序仪上，对PCR产物的单链模板进行测序反应，并实时检测测序结果。

本发明还提供了一种基于上述方法的核酸检测试剂盒，所述核酸检测试剂盒包括：

1）用于荧光定量PCR的各种反应试剂，例如：目的片段特异性的PCR引物、目的片段特异性的荧光探针、DNA聚合酶；

2）用于固定并制备PCR产物单链模板的试剂；

3）用于测序反应的试剂，例如：目的片段特异性的测序引物。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述核酸检测试剂盒还包括：PCR反应液、测序反应液、阴性质控品、阳性质控品、定量标准品、尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）、dUTP。

由于采用了上述的技术方案，本发明提供的一种结合荧光定量PCR的焦磷酸测序方法，克服了普通PCR的弊端：

（1）荧光定量PCR反应时间较普通PCR结合电泳检测的模式，缩短1-2个小时；

（2）无电泳、切胶纯化等操作，最大限度减少了PCR产物气溶胶，降低了假阳性风险；

（3）荧光定量PCR的灵敏度高，一些电泳检测没有条带或条带模糊PCR产物，也能进行焦磷酸测序，降低了漏检率；

（4）无切胶纯化等操作，避免PCR产物的大量损失；

（5）通过荧光值判断PCR产物的量，较电泳图确认准确度更高，进而提高测序峰图的质量。