[发明专利]一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，设计药用糜蛋白酶的生化分离技术。具体地说是采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取糜蛋白酶。 

背景技术

糜蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺等哺乳动物胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它在药理和临床上的功用主要有两方面：一、消炎：对各种炎症、炎性水肿、血肿、溃疡及血栓等有较好疗效。二、抗癌：能促进抗癌药物向病灶渗透，促使化疗药物发挥作用，局部大剂量使用时作用更强。大剂量使用可治疗多种肿瘤，如乳腺癌、宫颈癌、胃癌等，并且无任何毒副作用或不良反应。 

目前中国市场上生产糜蛋白酶的厂家有十几家，但多采用传统工艺法生产，制备的糜蛋白酶效价低，而且不稳定。中国专利CN1944641A公开了一种糜蛋白酶的制备方法，采用亲和层析工艺从糜蛋白酶原生产高纯度糜蛋白酶，但是正如中国专利CN1013025B分析，也存在一些缺点，最主要的，亲和层析介质昂贵，可重复使用次数少，介质的使用量大，不适合规模化大生产。而中国专利CN1013025B虽然解决了亲和层析的不足，也能获得高比活的糜蛋白酶，但同样，比较起传统工艺来，生产成本太高。在原料的选择上，中国的厂家亦局限于采用牛胰脏或猪胰脏制备糜蛋白酶。可是随着糜蛋白酶的应用广泛，使得国际市场对本产品的需求不断扩大，质量要求上更加严格，要求产品有更高的质量：《中国药典》(2010版)规定，糜蛋白酶的效价不得少于1000单位/毫克。针对市场需求的扩大和效价提高的要求，本发明采用羊胰脏为原料，对传统工艺进行了改进和创新。 

发明内容

本发明的目的就是为了生产高质量的糜蛋白酶而又降低生产成本，对传统工艺加以改造，尤其是参数的改造，提供了一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法，该方法包括如下步骤： 

1、糜蛋白酶粗制生产操作： 

(1)新鲜的羊胰脏，立即用镊子和剪刀将脂肪结缔组织等除去，置绞碎机中绞碎，称重。 

(2)绞碎物置塑料桶中，按1～3ml/g的比例加入0.125mol/L硫酸溶液浸渍20～30小时，在浸渍期中每小时搅拌1次。 

(3)将浸渍物置滤袋过滤，滤渣再按1～2ml/g的比例加入0.125mol/L硫酸溶液浸渍1～3小时，滤干后弃去滤渣。 

(4)将两次浸渍液合并置塑料桶中，每1000ml溶液中加入固体硫酸铵242g，使达40％饱和度，静置12～16小时。 

(5)过滤，留取过滤液，固体弃去。 

(6)在每1000ml清液中加入固体硫酸铵205g，使达70％饱和度，放置12～16小时。 

(7)过滤，留取固体，弃滤液。 

(8)将沉淀物按2～4ml/g的比例加水溶解，再按(4)(5)(6)(7)操作法分次加固体硫酸铵近40％和70％饱和度沉淀。 

(9)取70％饱和度沉淀物，按1～3ml/g的比例加水溶解，再按0.2～ 1.5ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.0～5.0。 

(10)将溶液静置20～28℃恒温箱中40～50小时，即有针状结晶(糜蛋白酶粗品)析出。抽滤，即得糜蛋白酶粗品。 

2、糜蛋白酶精制生产操作： 

(1)结晶工序 

投料：取糜蛋白酶粗品，置不锈钢桶内，按5～9ml/g的比例加水溶解，调pH值至2.5～3.5，搅拌8～10小时后，静置12～16小时。 

结晶I 

静置结束后搅拌，并调pH值至2.0～3.0。按1～3ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，搅拌10～30分钟，调pH值至4.0～5.0，置20～28℃条件下，保温40～48小时，过滤，收集滤饼，滤液弃去。 

结晶II 

按2～4ml/g的比例加入水溶解滤饼，调pH值至2.0～3.0，再按0.5～2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.0～5.0，置20～28℃条件下，保温20～24小时，过滤，收集滤饼。 

结晶III 

按2～4ml/g的比例加入水溶解滤饼，调pH值至2.0～3.0，再按0.5～2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.0～5.0，置 20～28℃条件下，保温20～24小时，过滤，收集滤饼。 

结晶IV 

按2～4ml/g的比例加入水溶解滤饼，调pH值至2.0～3.0，再按0.5～2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.0～5.0，置20～28℃条件下，保温20～24小时，过滤，收集滤饼。 

(2)活化工序