[发明专利]庆大霉素JI-20B基因工程菌及其构建与应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物制药领域，涉及庆大霉素JI-20B化合物的研制，包括庆大霉素JI-20B工程菌的构建及其制备，可应用于抗生素制药领域。 

背景技术

小单孢菌（Micromonospora）是一属能产生多种具有临床应用价值药物的微生物，在先后报道的60 种小单孢菌中，有40 多种产生抗生素，其中包括大环内酯类、氨基糖苷类、安莎类和蒽环类等。小单孢菌不仅可以产生链霉菌所产生的抗生素，还产生庆大霉素(Gentamicin)、西索米星(Sisomicin)、阿司米星(Astromivin) 等。小单孢菌具有合成潜在药物的巨大潜力，日益受到科学家的重视。 

庆大霉素(Gentamicin，GM) 可由绛红色小单孢菌(Micromonosporapurpurea)、棘孢小单孢菌（Micromonospora echinospora ）等稀有放线菌，经发酵生产氨基糖苷类抗生素，对多种革兰阴性菌和阳性菌有较强的抗菌作用，对绿脓杆菌特别有效。是目前我国大规模生产的重要抗生素，可供全世界需要，成为我国大量出口的特色原料药。更为重要的是庆大霉素生物合成中间体，是开发新药的源泉，但至今未能取得显著突破，关键是获得庆大霉素生物合成中间体非常困难。 

庆大霉素各组分在结构上很接近，分别由绛红糖胺、2-脱氧链霉胺和加洛糖胺通过糖苷键连接而成。根据分子结构的差异可以分为庆大霉素C，庆大霉素A，庆大霉素B 和庆大霉素X 族等。庆大霉素C 是主组分。因绛红糖胺C6上的甲基化程度不同，形成了庆大霉素C1、C2 、C2a和C1a等。最新研究发现，氨基糖苷类抗生素还具有抗肿瘤和抗病毒[Henna Kim, Mi-Kyung Lee, Junsang Ko, Chin-Ju Park, Meehyein Kim, Yujeong Jeong, Sungwoo Hong, Gabriele Varani, Byong-Seok Choi. Aminoglycoside antibiotics bind to the influenza A virus RNA promoter. Mol. BioSyst ., 2012, 8, p2857–2859；Maruthi Chittapragada, Sarah Roberts and Young Wan Ham. Aminoglycosides: Molecular Insights on the Recognition of RNA and Aminoglycoside Mimics. Perspectives in Medicinal Chemistry 2009,3, p 21–37.]等新功效。庆大霉素JI-20B具有抗菌、抗原虫等功能，还是进一步合成抗病毒，抗肿瘤药物的重要前体。 

基于本研究在国内首先完成构建了庆大霉素生物合成基因文库（Genbank accession No.:JQ975418），国内外科学家对氨基糖苷类抗生素的生物合成途径理论推测逐步阐明[Sung Ryeol Park, Je Won Park, Yeon Hee Ban, Jae Kyung Sohng, Yeo Joon Yoon. 2-Deoxystreptamine-containing aminoglycoside antibiotics: Recent advances in the characterization and manipulation of their biosynthetic pathways. Nat. Prod. Rep. , 2013, 30, p11-20],为开发庆大霉素生物合成中间体奠定了重要基础。根据这一重要资源优势，引发了发明系列庆大霉素生物合成中间体的研制与开发，并取得了显著效果。 

根据生物信息学技术分析，genB3（gntJ）基因编码C6`氨基转移酶，而genP(gntI)与3’，4’双脱氧相关。因此，如果敲除这两个基因，将得到主产JI-20B的工程菌。 

科学研究所需的微量庆大霉素JI-20B是从庆大霉素的发酵液中分离得到。从庆大霉素生物合成途径中,制备庆大霉素JI-20B，非常困难。这种制备方法，工艺复杂，操作困难，条件难以控制，成本高，收率低，最终得到的目标产物,其纯度仍然不一定能达到所需的要求，因此，更不适合于规模化生产，导致国内外至今在制备庆大霉素JI-20B上无法实现产业化。