[发明专利]从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷IIE的方法

说明书

技术领域

    本发明涉及生物技术领域的提取方法，具体说是一种从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷IIE的方法。

技术背景

    罗汉果，为葫芦科植物罗汉果属多年生草质藤本植物罗汉果的果实，为一常用中药，具有清热解暑、入肺止咳作用，临床上可用于治疗高血压、肺结核、哮喘、胃炎、百日咳、急慢性支气管炎和急慢性扁桃体炎等多种疾病。 

罗汉果葫芦烷型糖苷是其中主要的有效成分，具有化学防癌、抑制肠麦芽糖酶和血糖升高等作用，是目前罗汉果开发应用最多的一类成分。而罗汉果苷IIE是未成熟罗汉果的主要皂苷成分，味道极苦，随着罗汉果的生长，其相继转变为罗汉果苷III、罗汉果苷IV等，最终主要成为味道极甜并具有多种药理活性的罗汉果苷V。由此可见罗汉果苷IIE是生物合成罗汉果苷V的前体化合物。同时研究还表明罗汉果多糖苷在动物体内代谢过程中会脱去葡萄糖基转化成罗汉果苷IIE和罗汉果醇，因此罗汉果苷IIE引起越来越多研究者的关注。

目前尚未有系统提取分离罗汉果苷IIE的研究方法。

发明内容

    本发明的目的是提供一种从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷IIE的方法，工艺简单，具有纯度高，收率高，生产成本低等优点。

本发明通过以下技术方案实现，具体包括如下步骤：

（1）先将30-45天左右的新鲜罗汉果去皮，破碎，加入5-10倍的甲醇/乙醇浸提7-10天，滤过，回收甲醇/乙醇得醇浸膏；上述操作可重复1-2次； 

（2）将醇浸膏悬浮于水，上D101树脂柱层析，水洗去除杂质，然后用80-100%的甲醇/乙醇洗至无罗汉果苷IIE洗出，醇洗脱液浓缩得到粗皂苷；

（3）粗皂苷进行硅胶柱层析，干法上样，氯仿-甲醇洗脱，收集含罗汉果苷IIE的组分，合并，回收溶剂，得罗汉果苷IIE粗品；

（4）取罗汉果苷IIE粗品，用水溶解，进行HP-20ss树脂柱层析，水洗，60%乙醇洗脱，收集纯度在85-91%流分，合并，回收溶剂，即得到纯度为85-91%的罗汉果苷IIE；

（5）取纯度85-91%的罗汉果苷IIE，溶解于甲醇/乙醇，用制备型高效液相色谱仪，C18色谱柱进行制备，以乙腈-水为流动相，收集罗汉果苷IIE色谱峰对应的流分，合并，回收溶剂，得到纯度大于98%的罗汉果苷IIE。其IR、MS、¹H-NMR、¹³C-NMR数据与罗汉果苷IIE一致。

步骤（2）中所述的醇浸膏悬浮于水，水用量为醇浸膏重量的2-4倍。

步骤（2）中所述的醇浸膏通过D101柱，D101树脂的用量为醇浸膏重量的20-60倍。

步骤（2）中所述水洗至无罗汉果苷IIE洗出的检测条件为，用硅胶G薄层检测，展开剂选用CHCl₃-MeOH-H₂0，配比是8：2：0.1，10% H₂SO₄乙醇溶液为显色剂，罗汉果苷IIE的Rf为0.59-0.62。

步骤（3）所述的硅胶柱中，干法上样时拌样的样品与硅胶的比例为1：1（重量/重量），装柱的硅胶用量为粗皂苷重量的30-100倍，氯仿-甲醇洗脱各比例为25：1-7：1。

步骤（4）所述的HP-20ss树脂柱，树脂用量为罗汉果苷IIE粗品重量的50-200倍。

步骤（4）中收集含罗汉果苷IIE在85-91%的组分，其收集检测方法为高效液相色谱法，检测条件为：采用C18色谱柱，以乙腈-水梯度洗脱，检测波长为203nm，流速为0.8ml/min。

步骤（5）所述制备型高效液相色谱制备法的制备条件为，以C18为色谱柱填充剂，以乙腈-水梯度洗脱，检测波长为203nm，流速为10ml/min；检测方法同步骤（4）。

本发明有益效果是：在进行罗汉果皂苷分离纯化时，多数采用C18材料，鲜有用HP-20ss树脂进行细分的，后者比前者的优势在于流速比较快，同时实验表明其在分离罗汉果苷IIE的效果也很好，利用两次洗脱就能得到含量大于85%的产品。最后采用制备型高效液相色谱进行制备，结果表明所用条件可以在很短时间内获得高纯度单体化合物。因此该分离工艺新颖、操作方便、收得率高、产品纯度高、纯化效果好的，利用此工艺可获得了大量的高纯度罗汉果苷IIE。

附图说明

图1为本发明罗汉果苷IIE的结构图；

图2为实施例罗汉果苷IIE制备液相色谱图；

图3为实施例罗汉果苷IIE纯度检测液相色谱图。

具体实施方式