[发明专利]一种诊断人类脊髓性肌萎缩症的荧光定量PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及核酸的测定或检验方法的试剂。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)是一组常见的常染色体隐性遗传病，居致死性常染色体隐性遗传病的第二位，活产婴儿中患者发生率为1/6000～1/10000。临床上，SMA一般分为4种类型：Ⅰ型（又称Werding-Hoffman病）是最严重的亚型(重型)，约占SMA患者的一半，发病急、进展快，一般在出生6个月之内发病，多于2岁之内死亡；SMAⅡ型为慢性婴儿型(中间型)，通常在7～18个月内发病，大多可以存活10～20岁；SMAⅢ型（又称Wohlfart-Kugelberg-Welander病）为青少年型(轻型)，出生18个月后才发病，病情发展缓慢，一般可存活至成年，多因呼吸肌麻痹或全身功能衰竭死亡；SMAⅣ型则为成年型(极轻型)，一般于20～30岁以后发病，主要表现为缓慢逐渐发生的上下肢近端无力和肌肉萎缩，成年期都能够行走。总的来说，SMA为致死性疾病，神经肌肉疾病病情严重，目前临床上无有效治疗手段。

正常情况下，人类机体会正常表达SMN蛋白和NAIP蛋白，而维护脊髓前角细胞功能。当SMN蛋白和NAIP蛋白表达下降甚至消失后，将导致脊髓前角细胞变性，从而使个体身体躯干和四肢近端骨骼肌进行性肌无力、肌萎缩，即脊髓性肌萎缩症(SMA)。SMA的病因是由于SMA相关基因（主要包含SMN基因和NAIP基因）缺失或突变，导致SMN蛋白和NAIP蛋白表达下降甚至消失而发病，因此通过检测SMN基因和NAIP基因缺失或突变状况，是SMA的主要确诊方法。

人类SMA相关基因位于5号染色体长臂1区3带2亚带（5q13.2）上，包括脊髓运动神经元(Spinal Motor Neurons,SMN)基因和神经元细胞凋亡抑制蛋白(Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein,NAIP)基因。其中SMN基因全长20kb，包括9个外显子和8个内含子，有两个非常相似的基因拷贝，即位于端粒端的SMN1(或称SMNt)和位于着丝粒端的SMN2(或称SMNc)。SMN1和SMN2为两个高度同源的倒位重复DNA序列，仅在3’端有5个碱基的差异，尤其是SMN2因第7外显子与SMN1的单个碱基差异(c.840C>T)，导致此两个基因拷贝所编码的蛋白产物不同，即SMN1编码完整而稳定的SMN功能蛋白，而SMN2主要编码功能缺陷的截短SMN蛋白，少部分（10%-50%）编码完整而稳定的SMN功能蛋白，在SMN1基因功能完全丧失时，SMN2基因的表达对SMN蛋白的功能具有一定的补充作用，被定义为SMA的修饰基因。NAIP基因全长70kb，包括16个外显子和15个内含子，编码的NAIP蛋白通过阻断细胞信号转导通路中的caspase-3和caspase-7的激活抑制神经细胞凋亡，NAIP蛋白功能缺失，使前角运动细胞凋亡过度，导致运动神经元受损，引起继发性肌肉萎缩，加重SMA病情，因此NAIP基因也被定义为SMA的修饰基因。

目前的研究已经表明，SMA的病因主要是SMN基因和NAIP基因部分序列缺失：其中SMN1为决定基因，表达完整而稳定的SMN功能蛋白，SMN2作为SMA的修饰基因，所表达的具有生物活性SMN蛋白量虽然较少，但随着其拷贝数增加会有表达量的累积效应，从而使患者的临床症状有一定程度的减轻。有关NAIP基因，研究显示其缺失(缺失范围为外显子5和6)与SMA病情严重程度相关，涉及到NAIP基因缺失的SMA病人临床表型重，仅为单独的SMN基因缺失而未涉及NAIP基因缺失的SMA病人则临床表型轻。据报道，98.7%(226/229)儿童型患者存在SMN1基因缺失，其中约90%的SMA病人显示纯合SMN1外显子7和/或8缺失。Iannaccone等报道由于基因转化，SMN2在人群中的基因拷贝数为0-4个，而不只是2个拷贝。本课题调查了1712个中国人新生儿SMN2的拷贝数，发现中国人群中SMN2基因拷贝数不均衡是普遍的现象。据此，SMN1基因序列纯合缺失导致SMN蛋白功能丧失为SMA确诊指标，SMN2和NAIP基因功能状态影响疾病临床表型的严重程度。所以同时检测SMN1、NAIP三个基因目的片段的缺失或多拷贝的数量不仅可以准确诊断SMA，并且对分析估测SMA的临床表型十分必要。