[发明专利]一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫病毒生物农药检测技术领域，具体涉及一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒，该PCR试剂盒不仅可使用目前存在市场上的所有类型荧光定量PCR仪器，更重要的是能快速地对黑胸大蠊浓核病毒进行定性、定量检测，还涉及一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法，方法简单，易行。

背景技术

蟑螂学名蜚蠊，属于昆虫纲（Insecta）、直翅目（Blattaria）、蜚蠊科（Blattidae）。蟑螂是一种非常古老的昆虫，早在3亿年前就已出现，素有活化石之称。同时蟑螂又是危害人类健康的重要卫生害虫之一，其危害不亚于蚊虫、苍蝇及老鼠的一类重要卫生害虫，已知蟑螂体内外能携带霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等多种细菌和钩虫、蛔虫、鞭虫等十种寄生虫卵，可在体内贮存多天，并不断排出体外，污染周围环境。多年来防治蟑螂的主要方法是使用化学农药，造成了蟑螂抗药性增强，且一年多次用药，造成环境污染，现在人民生活水平逐步提高，在家庭灭蟑上都希望采用生物农药，而应用微生物防治蟑螂已有很多报道，其中从自然罹病蟑螂体内分离到的黑胸大蠊浓核病毒对蟑螂有非常好的感染性，死亡率高达99%。

黑胸大蠊浓核病毒（Periplaneta fuliginosa densonucleosis virus，PfDNV）是武汉大学胡远扬教授等人在国内首先发现并报道，是在国内外第1个正式分类鉴定的蟑螂浓核病毒。该病毒与其他细小病毒一样，病毒粒子无包膜，呈球状二十面体对称，直径22nm基因组为单链线状DNA分子（ssDNA），沉降系数为102s，浮力密度为1.42g/ml，可以通过差速离心和密度梯度离心的方法将其分离提纯。病毒粒子的SDS-PAGE显示由5个蛋白组成，分子量分别为52KD，56KD，79KD，82KD，105KD。PfDNV基因组全长为5454bp（PfDNV基因组序列已提交Genbank，编号为：AF192260.1）。基因组正链有4个大的阅读框（ORF），负链含有3个大的阅读框，分别编码非结构蛋白和结构蛋白。ICTV第九次会议正式将其独立列为一个属：Pefudensovirus。黑胸大蠊浓核病毒可引起蟑螂食欲减退，行动迟缓，后体翻仰卧不能自正，直至不动而死去。死后虫尸外观体形体色不变，体软腐，压之流出乳白色脓液，无臭味；此病毒最显著的病症是嗉囊特别膨胀，呈白色鱼泡状的气囊，气囊一般伸达第2-4腹节，有的甚至占住整个血腔，将中、后肠挤压至尾端一侧，囊内空而无物，破之气消瘪缩；其次是中肠稍肿胀，黑褐色，破之，流出黑褐色液体；后肠黑色，滞留有未排出的粪便。目前应用黑胸大蠊浓核病毒制成的杀蟑产品有拜乐生物杀蟑饵剂、方便贴、拜乐生物杀蟑饵盒等产品。而产品的不断推出，需要有更快更简单的方法对其有效成分黑胸大蠊浓核病毒进行定性定量检测，才能保证产品的质量。近年来，实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)以其特异性高、灵敏度高、可定量、有效解决PCR污染问题及自动化程度高等优点，在生物农药、医学领域、微生物和动植物疾病检疫方面得到了广泛应用（杨和平、孟小林、徐进平等.荧光定量PCR技术检测样品中SeMNPV有效含量[J].中国病毒学，2006，21（5）：494-498.乔鲁芹，曲良建，王玉珠等.美国白蛾核型多角体病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].昆虫病毒,2010,53（7）：824—830.Petersen E,Edvinsson B,Lundgren B,et a1.Diagnosis of pulmonary infection with Toxoplasma gondii in immunocompromised HIV-positive patients by real-ime PCR[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2006,25(6):401-404.;Goldschmidt P,Rosne H,Saint-jean C,et a1.Effects of topical anaesthetims and fluorescein Oil the real-time PCR used for the diagnosis of Herpesviruses and Acanthamoeba keratitis[J].Br J ophthalmol,2006,90(11):1354-1356.;Regis S,Grossi,Laldi S,et a1.Diagnosis of Pelizaeus-Merzbacher disease：detection of proteolipid protein gene copy numher by real-time PCR[J].Neurogenetics,2005,6(2):73-78.;Lobetti R G,Tasker S.Diagnosis of feline haemoplasma infection using a real-time PCR assay[J].J S Afr Vet Assoc,2004,75(2):94-99.;Ordinaire I,Simon A,Frealle E,et a1.Real-time quantitative PCR for toxoplasmosis diagnosis[J].Ann Bio1Clin,2005,63(1):67-73.;Ovarnstrom Y,James C,Xayavong M,et al.Comparison of real-time PCR protocols for differential laboratory diagnosis of amebiasis[J].J Clin Microbiol,2005,43(11):549l-5497.;Knorr L,Fox J D,Tilley P A,et a1.Evaluation of real-time PCR for diagnosis of Bordetella pertussis infection[J].BMC Infect Dis,2006(6):62-64.;Vanden B R,Kuijper E J,Vancopdenraer C L,et a1.Rapid diagnosis of toxinogenic Clostridium difficile in faeeal samples with internally controlled real-time PCR[J].Ciin Microbiol Infect,2006,12(2):184-186.;Machida U,Kami M,FukuI T,et a1.Real-time automated PCR for early diagnosis and monitoring of cytomegalovirus infection after bone marrow transplantation[J].J Clin Microbiol,2000,38(7):2536-2542.）