[发明专利]一种人源CTLA4融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人源CTLA4融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）是T淋巴细胞表面的受体，是抑制T细胞活化的共刺激分子，当T细胞表面受体CTLA4与APC上的B7分子结合后，会抑制T细胞的活化，从而抑制T细胞的过度活化。很多过度免疫反应引发的疾病均与CTLA4蛋白的低表达有着极为密切的关系，如同种异体移植引发的免疫排斥反应、慢性支气管哮喘、风湿性关节炎（RA）、艾滋病、系统性红斑狼疮、银屑病、内毒素性休克病等疾病，因此CTLA4蛋白或融合蛋白在这些疾病的特异性治疗方面有着十分广阔的应用前景。此外，CTLA4蛋白在机体内的过度表达与很多疾病特别是肿瘤有着密切的关系，如黑色素瘤、白血病、部分胃癌和食道癌、利什曼病等。CTLA4的单克隆抗体CTLA4mAb可广泛用于抗肿瘤的免疫治疗，是目前肿瘤基因治疗的研究热点及方向。获得具有生物学功能、接近人类天然CTLA4蛋白的重组蛋白是CTLA4特异性治疗疾病的关键。

因此，有必要提供一种人源CTLA4融合蛋白。

发明内容

为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种人源CTLA4融合蛋白。本发明第二方面提供了一种人源CTLA4融合蛋白的制备方法。本发明第三方面提供了一种人源CTLA4融合蛋白的应用。

第一方面，本发明提供了一种人源CTLA4融合蛋白，所述人源CTLA4融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述人源CTLA4融合蛋白由如SEQ ID NO：2所示的基因编码。

本发明提供的如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列包括Kex2蛋白酶酶切位点的编码序列和CTLA4胞外区的编码序列（Gene Bank克隆号：NM-005214.3）。

优选地，所述人源CTLA4融合蛋白的氨基酸序列还包括编码His标签的氨基酸序列。

优选地，所述人源CTLA4融合蛋白的氨基酸序列还包括编码c-myc标签的氨基酸序列。

优选地，本发明的人源CTLA4融合蛋白的C末端含有1个c-Myc标签和1个6His组氨酸标签，便于筛选。

优选地，所述人源CTLA4融合蛋白由含有编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的基因的pPICZaA重组载体表达获得。

优选地，本发明提供的人源CTLA4融合蛋白是在真核表达系统毕赤酵母GS115菌株中分泌表达的可溶性蛋白。

本发明提供的人源CTLA4融合蛋白包含人源CTLA4融合蛋白的胞外区部分，大小为22～28KD，是全长CTLA4蛋白大小一半。

第二方面，本发明提供了一种人源CTLA4融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）、提供或制备pPICZaA重组载体，所述pPICZaA重组载体含有编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的基因；

（2）、将步骤（1）所得pPICZaA重组载体采用Sal I限制性内切酶进行线性化，再采用电击法将线性化后的pPICZaA重组载体转化到酵母GS115感受态细胞中；

（3）、采用Zeocin抗性筛选阳性酵母菌株；

（4）、采用甲醇诱导人源CTLA4融合蛋白的表达，得到所述人源CTLA4融合蛋白。

优选地，所述步骤（1）中，构建pPICZaA重组载体的过程中，所述编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的基因插入所述pPICZaA质粒的Xho I和Xba I位点。

优选地，所述步骤（1）中，提供或制备pPICZaA重组载体的方法，包括如下步骤：

1）、设计CTLA4基因胞外区片段的上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的碱基序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

2）、提供或制备CTLA4基因模板，并以步骤（1）所得上游引物和下游引物为PCR引物，扩增CTLA4基因胞外区片段；

3）、取pPICZaA质粒，将步骤（2）扩增得到的CTLA4基因胞外区片段和所述pPICZaA质粒利用相同的内切酶分别进行双酶切反应，纯化回收后进行连接，得到所述重组载体。

优选地，所述步骤2）中，所述CTLA4基因模板为含有CTLA4基因的重组载体pGEM-T-CTLA4。