[发明专利]定量检测白假丝酵母菌的引物和探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量检测白假丝酵母菌的引物和探针及其应用。

背景技术

白假丝酵母菌（Canidia Albicans）又称白色念珠菌，属于真菌界半知菌亚门、芽孢菌纲、隐球酵母目、隐球酵母科。广泛存在于自然界，也存在于健康人群口腔，上呼吸道，肠道以及阴道等部位，一般在正常机体总数量少并不引起疾病，为条件致病菌，无症状时常表现为酵母细胞状，侵染组织和出现症状时表现为菌丝性。

近年来，随着广谱抗菌药物的滥用、癌症放疗化疗的增多、器官移植免疫抑制剂及大量激素的临床应用，深部真菌感染率大幅上升，已成为上述疾病患者死亡的主要原因。白假丝酵母菌是最常见的医院感染致病真菌，50%以上的病例是由白假丝酵母菌感染引起的，同时也是引起女性生殖道感染的常见致病菌。假丝酵母菌引发的菌血症死亡率较高，达到40%-80%，有报道深部白假丝酵母菌感染病死率达68.9%。近年来白假丝酵母菌引起的外阴阴道炎（Vμlvovaginal candidiasis，VVC）的发病率呈上升趋势，大约75%的生育妇女至少有1次VVC发作史。

目前对白假丝酵母菌的实验室诊断主要有常规涂片镜检、培养法以及常规PCR等。常规涂片镜检检测具有简便、快速、廉价等优点，但是要求检测者具有丰富检测经验，同时敏感度低、特异性差、误判率高等缺点，需用科玛嘉显色培养基进一步验证；科玛嘉培养基含有特殊的显色物质，通过培养观察菌落颜色即可对白假丝酵母菌进行定性和定量，但是培养耗时长（48小时），易污染等缺点，滞后于临床治疗，不利于快速诊断；常规PCR技术也存在灵敏度低、易污染等缺点造成假阳性。

实时荧光定量PCR（Fluorescence quantitative PCR）技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，它相对常规PCR技术先进、操作简便、利用实时荧光定量PCR技术能够实现实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点，因此非常适合临床检测。浙江大学申请了关于肠道白假丝酵母菌检测的荧光定量PCR检测试剂盒（专利号CN200910098555.3），但是采用了SYBR Green染料法，该方法虽然灵敏度高但是假阳性率高。泰普生物科学有限公司根据白假丝酵母菌的耐药基因ERG11基因设计了检测引物和探针，建立了一种白假丝酵母菌的荧光定量PCR检测试剂盒（CN201110417477.6）。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一组白假丝酵母菌（Canidia Albicans）特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于临床的快速、灵敏、特异性好的用荧光定量PCR检测方法。

本发明采用基因克隆技术，将白假丝酵母菌ITS DNA片段插入到载体pMD18-T中，获得含有ITS片段的重组质粒，以此作为标准品。根据白假丝酵母菌ITS DNA片段中高度保守特异性强的核酸序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量PCR技术为平台的检测方法，并对所建立的方法进行有效性评估试验。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一对白假丝酵母菌ITS基因保守片段序列的引物，所述引物的核苷酸序列为序列表中序列1和序列2，称其为外围引物，用于标准品的制备，所述外围引物为：上游引物为5'-ATGAAGAACGCAGCGAAATG-3'，下游引物为5'-CGCAAGCAATGTTTTTGGTTAG-3'，采用该引物以白假丝酵母菌标准菌（CMCC98001）的DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物为242bp。

本发明的第二个目的是提供了一组用于定量检测白假丝酵母菌的引物和探针，所述引物的核苷酸序列为序列表中序列3和序列4；所述探针的核苷酸序列为序列表中序列5。探针为Taqman探针，该组引物和探针是根据上述ITS保守片段设计,其中上游引物为5’-CCTAAGCCATTGTCAAAGCGA-3’，下游引物为5’-TGCCTGTTTGAGCGTCGTT-3’，探针为5’-TCCCGCCTTACCACTACCGTCTTTCAAG-3’。

本发明的第三个目的是提供了一组如上所述的用于定量检测白假丝酵母菌的引物和探针的衍生序列，所述引物的衍生序列包括引物序列的互补链序列、引物序列向5’端和3’方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列；所述探针的衍生序列包括探针5’端标记有荧光报告基团FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA、DABCYL或BHQ。