[发明专利]利用连续流动的管式微反应器酶促合成异槲皮苷的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生化制药领域，具体涉及一种利用连续流微反应器酶促合成异槲皮苷的方法。

背景技术

异槲皮苷是一种具有抗肿瘤、抗氧化和降血糖等生物活性的天然黄酮类化合物，是是食品着色剂（Enzymatically modified isoquercitrin）EMIQ的合成中间体(Food Chem.,2009,116(1):214-219)。异槲皮苷可以从桑叶、田基黄等植物中提取，如CN102827220A公开了从荷叶中用柱层析法来分离得到异槲皮苷，但是天然产物中异槲皮苷含量极低，远远无法满足市场需求。此外，异槲皮苷可通过化学法制备，如CN1817876A公开了一种在高压反应釜里加热水解芦丁制备异槲皮苷，但是产物中异槲皮苷和槲皮素共存，其中异槲皮苷最高得率只有13%，大部分是槲皮素。因此，考虑到提取法和化学法成本过高，近年来酶促选择性水解芦丁制备异槲皮苷是公认的有效途径。

以价格低廉的芦丁为底物，对其鼠李糖苷键进行酶法选择性水解获得异槲皮苷，为异槲皮苷的生产提供了新的思路。如Petr等用鼠李糖苷酶催化芦丁水解产异槲皮苷，反应25h转化率可达93%(Bioresour.Technol.,2011,115(0):222-227)。但是，该水解过程酶切效率较低，反应时间长，酶的价格昂贵且重复利用度低，这都限制了异槲皮苷的生产效率。Wang等在新型的离子液体共溶剂反应体系中，用橙皮苷酶水解芦丁产异槲皮苷，反应10h转化率就可达93.4%(Bioresour.Technol.,2013,128,156-163)，该方法相对于传统方法在反应时间上大为缩短，但仍有待进一步完善。因此，急需在此催化新体系基础上寻找一种制备异槲皮苷更加高效的新技术。

自20世纪90年代中期微反应器技术兴起以来，由于其独特的特色和优势迅速成为研究热点，在生物催化领域中得到了越来越多的应用。连续流管式微反应器（Continuous-flow microreactor）是一种连续流动的管道式反应器，其反应空间的尺寸数量级一般为微米甚至纳米。与常规反应器相比，连续流管式微反应器具有表面积大，传质、传热效率高、便于放大等优点(Lab Chip.,2012,12,4080-4084)。Du等研究了在微反应器中用脂肪酶TLIM催化糖酯的合成，其将脂肪酶固定在2mm内的管道中。与传统的反应器比较，其反应30min就可以达到90%左右的得率，同时副产物更少了（RSC Adv.,2012,2,2663-2665）。然而，尚未见用连续流管式微反应器酶促水解芦丁合成异槲皮苷的方法。

因此，本发明首次利用连续流管式微反应器来酶促水解芦丁合成异槲皮苷，有利于提高酶促反应效率，缩短反应时间，减少耗能，且操作简单，易于工业化生产高纯度的异槲皮苷，为推动其在化妆品、药品、食品等工业中具有十分重要的意义。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供了一种利用连续流管式微反应器酶促合成咖啡酸丙酯的方法，以解决现有技术中存在的合成异槲皮苷的反应速率低、耗时长及难以连续化生产等问题。

技术方案：利用连续流动的管式微反应器酶促合成异槲皮苷的方法，采用微米级别内径的连续流动的管式微反应器，以pH9的甘氨酸-NaOH为缓冲液配制浓度为0.01～5g/L的芦丁母液，以橙皮苷酶为催化剂，酶用蒸馏水按浓度0.001g/mL～0.1g/mL配比，在反应体系中加入离子液体[Bmim][BF₄]，芦丁母液、酶液和离子液体分别按体积比72:18:10配比，用微量注射泵以0.1～100μL/min的流速，将反应液泵入微反应器中进行酶促反应，温度控制在20-60℃。

所述管式微反应器设有依次连接的进样口、微管道和出样口，反应器的进样口端与微量注射泵连接，反应器的出样口端与收集器连接，微管道为蛇形通道，通过热注塑法或是蚀刻法刻出，通道的尺寸内径为长0.25m-2m，宽100-500μm，深50μm，微反应器材质为玻璃、PDMS(polydimethylsiloxane)或PMMA(Poly(methyl methacrylate))。

所述的缓冲液中芦丁的浓度优选为0.1g/L。

所述的酶液浓度优选为为0.1g/mL。

所述的用微量注射泵控制的流速优选为2μL/min。

有益效果：