[发明专利]一种DC细胞的快速制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞制备领域，具体地说是一种DC细胞的快速制备方法。

背景技术

DC细胞，即为树突状细胞(Dendritic Cell)，是机体免疫系统功能最强大的专职抗原提呈细胞，通过摄取、加工处理和提呈抗原，启动抗原特异性免疫应答，在机体免疫系统抵御病毒感染、肿瘤侵袭中发挥着关键作用。近年来，国内外多个研究团队利用抗原特异性DC疫苗治疗肿瘤等疾病均已取得令人鼓舞的进展，部分已进入临床试验阶段。

但是，DC细胞数量稀少，仅占人外周血单个核细胞的1%，而DC疫苗需要大量成熟DC细胞，目前只允许通过分离患者自体单核细胞，再进一步体外诱导扩增来获得。因此，高效大量获得成熟并具有功能的DC细胞成为抗原特异性DC疫苗治疗疾病成功的决定性环节。

常规的DC细胞体外诱导扩增方案，是利用细胞因子：GM-CSF和IL-4，经过5~7天的诱导分化，紧接着再经过2天的诱导成熟，从而获得成熟并具有功能的DC细胞，总培养时长在7~9天。常规的DC细胞体外诱导扩增方案存在操作耗时长、细胞纯度低、细胞功能缺失等问题，导致DC疫苗产业化、批量化生产进程缓慢，进而难以推广应用。所以，寻找成本低、时程短的功能性DC细胞体外诱导扩增方式显得尤为迫切。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种诱导时间短、细胞纯度高、功能强的DC细胞的快速制备方法。

为了达到上述目的，本发明是一种DC细胞的快速制备方法，其特征在于：依次完成如下步骤： 步骤一：在3毫升淋巴细胞分离液中以每分钟1毫升的速度加入5毫升全血，保持淋巴细胞分离液液面不被冲破，在室温状态下，采用300g离心力，离心20分钟，离心过程中提速及减速均不带刹车； 步骤二：用滴管吸取云雾层，加入0.9%的生理盐水30毫升洗涤一次，在室温状态下，采用300g离心力，离心5分钟，弃上清； 步骤三：用30毫升预冷的分选缓冲液重悬细胞，计数细胞数，在4摄氏度状态下，采用300g离心力，离心10分钟，弃上清； 步骤四：每1х10⁷个细胞加入30微升预冷的分选缓冲液、10微升 Fc受体阻断试剂和10微升生物素抗体混合液，进行混匀，混匀后，置于温度为4摄氏度的冰箱内，10分钟后取出； 步骤五：每1х10⁷个细胞加入30微升预冷的分选缓冲液和20微升抗生物素微磁珠，进行混匀，混匀后，置于温度为4摄氏度的冰箱内，15分钟后取出； 步骤六：加入1-2微升预冷的分选缓冲液，在4摄氏度状态下，采用300g离心力，离心10分钟，弃上清，加入500微升预冷的分选缓冲液重悬细胞； 步骤七：MS柱置于磁架上，加入500微升预冷的分选缓冲液，待液体完全流干后，加入500微升细胞悬液，收集流出的细胞，该流出的细胞即为CD14+的单核细胞； 步骤八：待液体完全流干后，加入500微升预冷的分选缓冲液洗柱，重复两次； 步骤九：计数收集的细胞数量，在4摄氏度状态下，采用300g离心力，离心10分钟，弃上清； 步骤十：用DC细胞培养基调节细胞浓度至0.5-0.6x10⁶个/毫升，将细胞悬液铺入6孔板中，每孔3毫升； 步骤十一：将6孔板置于温度为37摄氏度，二氧化碳浓度为5%的孵箱内，培养48小时后，补充加入诱导DC细胞成熟的混合因子； 步骤十二：继续培养24小时后，检测细胞数量、细胞活力、细胞表型及功能。

所述的步骤二中，所述的云雾层为单个核细胞层。

所述的步骤十中，所述的DC细胞培养基为GT551无血清培养基加入1000 U/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和500 U/mL白细胞介素4。

所述的步骤十一中，所述的诱导DC细胞成熟的混合因子为1000 U/mL肿瘤坏死因子、10000 U/mL白细胞介素1、1000 U/mL干扰素r、1微摩尔/升前列腺素E2、500 ng/mL CD40L、10 ng/mL 脂多糖、2.5 微克/毫升 R848。

本发明同现有技术相比，将制备时间由现有技术的7-9天缩短至3天；将DC细胞的活力由现有技术的68-75%提高至88-95%，纯度由现有技术的60-65%提高至80-90%；采用本发明方法制备的DC细胞具有完全成熟表型，表达趋化因子CCR7，分泌高浓度IL-12细胞因子并有效促进T细胞增殖。

附图说明

图1为本发明与现有技术制备的DC树突状细胞的MHC II类分子及共刺激分子表达水平对比图。

图2为本发明与现有技术制备的DC树突状细胞的趋化因子受体CCR7表达水平对比图。