[发明专利]一种褐飞虱细胞的原代培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及属于昆虫细胞培养技术领域，尤其涉及一种褐飞虱细胞的体外培养方法。

背景技术

随着生命科学的迅猛发展，在生物工程技术领域中，细胞工程已愈来愈受到重视。从某种意义上说，基因工程是现代生物技术的核心，而细胞工程是现代生物技术的基础和公用平台。自从Grace在1962年首次建立天蚕蛾细胞系以来，昆虫细胞培养技术得到了迅速发展，400多株昆虫细胞系得以建立，这包括常用的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）S2细胞系、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）的BTI-Tn-5B1-4（High Five）细胞系和草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Sf21细胞系及其克隆株Sf9。昆虫细胞系的建立，不但促进了昆虫生物学方面的基础研究，也大大促进了基于昆虫细胞的应用性研究。其中，昆虫细胞-杆状病毒表达系统（BEVS）是当今最具高效的真核表达系统，已广泛应用于β-干扰素等外源基因的表达。但是，现在已建立起的昆虫细胞系多来源于鳞翅目昆虫，来源于半翅目昆虫的细胞系为数不多，目前只有玻璃叶蝉（Homalodisca coagulata）和灰飞虱（Laodelphax striatellus）有细胞系建成的报道，这极大地限制了半翅目昆虫相关生物学的研究及其应用。

褐飞虱（brown planthopper，BPH，Nilaparvata lugens (St?l)）属于半翅目昆虫，是亚洲稻区的主要害虫之一。它主要通过吸食水稻韧皮部汁液、传播水稻病毒两种方式对水稻造成危害。褐飞虱的大面积暴发会引起水稻叶片干枯，分蘖枯萎，甚至形成“虱烧”。褐飞虱有很强的适应能力，能快速适应不利环境（如水稻抗性品种和杀虫剂），其致害性能快速变异，这可能与褐飞虱体内存在大量的共生菌有关。虽然通过高温或添加抗生素等方式可以获得少菌的褐飞虱种群，但是由于这两种方式对褐飞虱本身就有一定的副作用，因而在活体条件下难以研究褐飞虱和其共生菌的关系。而若有离体培养的褐飞虱细胞，则可以在离体条件下研究褐飞虱和其共生菌的互作，从而有助于阐明褐飞虱的致害性机制。另一方面，若有离体培养的褐飞虱细胞，也可以通过在细胞水平研究杀虫剂对褐飞虱的作用机制，有助于当前杀虫剂的改进和新杀虫剂的发明。但目前，关于褐飞虱细胞的体外培养技术，还未见报道。因此，建立起一种褐飞虱细胞的离体培养方法，有助于褐飞虱防治工作的开展，并最终有利于粮食的安全生产，这具有重要的社会和经济效益。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种褐飞虱细胞的原代培养方法。

本发明目的是通过以下技术方案得以实现的。

一种褐飞虱细胞的原代培养方法，按以下步骤进行：

（1）获取发育时间在3天到4天的褐飞虱胚胎：褐飞虱雌成虫和雄成虫配对后放入装有水稻（ASD7水稻）叶鞘的试管中，使它们在28℃条件下（白天黑夜时间比为L:D=16h:8h）产卵，在第二天的同一时间从叶鞘中剥出褐飞虱所产的卵，此卵定义为1天卵，依次获得褐飞虱的3天卵和4天卵；在解剖镜下，3天卵可看到明显的黄斑，而4天卵可观察到眼点；此3天卵或4天卵的发育时期处于反转期前后，适合于后续的胚胎细胞培养。

（2）褐飞虱细胞培养基的配制：本发明所述的褐飞虱细胞培养基的配制方法：分别称取Schneider’s insect medium (SIGMA，S9895) 12.25g，Medium 199（Applichem，A1327，9010）5.35g；Medium CMRL 1066（1×）（Gibco，11530-037）25mL；L-His·HCI·H₂O（SIGMA，H5659）2.36g；L-His（SIGMA， H6034）2.135g；胎牛血清（Hyclone，SV30087.02）149mL-248mL；CaCl₂（分析纯）0.3g；NaHCO₃（分析纯）0.2g；氨苄青霉素钠（上海生工，A0339）62mg；硫酸链霉素（上海生工，S0382）62mg；上述各成分混合，用超纯水充分溶解后，用2M NaOH或HC1溶液调节pH至6.5-6.6，而后用超纯水定容至1240 mL，经0.22μm微孔滤膜过滤后置于4℃备用；过滤过程采用无菌操作，胎牛血清的体积终浓度为12%-20%。