[发明专利]一种基于CRISPR基因敲除技术建立脆性X综合症灵长类动物模型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体为一种基于CRISPR基因敲除技术建立脆性X综合症灵长类动物模型的方法。

背景技术

脆性X染色体综合症（Fragile X syndrome, FXS）是X染色体连锁的一种最常见遗传性弱智，该病影响着约1/3600的男性和1/4000-6000的女性。病因是FMR1基因发生CGG高拷贝动态突变，导致FMR1基因甲基化（DNA methylation）和基因沉默 (gene silencing)，智力迟钝蛋白（FMRP）不表达或表达量降低导致。

有关FXS发病机理的知识主要来自对FMR1基因敲除小鼠模型的研究。FXS小鼠模型表现出部分与人类患者相似的临床症状，如：颤抖、运动共济失调、注意力缺陷、智力障碍。在分子水平，由于FMRP表达量减少或缺失，FXS神经元突触传递的相关蛋白表达量上调；在细胞水平，神经元突触的可塑性和发育受到影响，突触数量减少，树突变长、变细，树突基部的突起减少；促代谢型谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptor, mGluR）信号相关的长时程抑制（long-term depression, LTD）受到抑制。小鼠动物模型的建立使得对FXS的研究具有可操作性、重复性和可比性，有助于认识该疾病的发生机制。但是由于种系之间的差异，FXS小鼠动物模型的研究不能完全代替高等动物模型的研究，特别是在神经药理和毒性测试方面。因此建立灵长类FXS疾病模型，研究神经发育动态过程中出现的疾病表型变化，对阐明FXS发病机制非常必要。

人类疾病的动物模型是疾病机理研究和新药研发的重要基础。长期以来，生物医学基础研究主要依赖于啮齿类动物模型。但由于啮齿类动物与人类之间存在巨大的种属差异，使得基础研究成果不能有效地转化为临床应用。灵长类动物作为人类的近亲，其组织结构、免疫、生理、代谢和生殖等方面与人类高度相似，利用其创建的人类疾病模型，能比其他模式动物更好地复制人类传染性和非传染性疾病模型，并有效地模拟人类疾病的病理过程，可作为研究人类疾病的最佳模式生物。同时，灵长类动物研究成果能直接转化为临床应用，能更有效地预测新疫苗、新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果，大大降低新药研发的风险。

基因定点修饰是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点。Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9系统成功被改造为第三代人工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶（zinc finger nucleases, ZFNs）和类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases, TALENs）一样可用于各种复杂基因组的编辑。目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点InDel突变、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失。由于其突变效率高制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。

在对FXS疾病的研究中，迄今国内外尚无灵长类动物模型的报道。

发明内容

本发明针对现有FXS疾病小鼠动物模型的不足，公开了一种用CRISPR基因敲除技术建立FXS灵长类动物模型的方法，以期阐明FXS的发病机制。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于CRISPR基因敲除技术建立脆性X综合症灵长类动物模型的方法，包括以下步骤：

(1) 建立FMR1基因敲除食蟹猴模型；

(2) 食蟹猴动物模型的鉴定及相关功能分析；

(3) 食蟹猴动物模型的神经特征和学习记忆能力测试。

所述建立FMR1基因敲除食蟹猴模型，具体包括以下步骤：

1）CRISPR靶向修饰基因载体的构建；

2）食蟹猴促排卵和体外受精；

3）食蟹猴受精卵的显微注射；

4）受精卵体外培养、植入受体及靶向基因修饰动物的培育。

所述食蟹猴动物模型的鉴定及相关功能分析，具体包括以下步骤：

1）对CRISPR靶向位点进行DNA测序鉴定食蟹猴动物模型的基因型；

2）利用实时定量PCR（real-time PCR）检测食蟹猴细胞中FMR1基因mRNA水平的降低；