[发明专利]一种菠萝成熟衰老相关基因的分子标记方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种菠萝成熟衰老相关基因的分子标记方法技术领域。

背景技术：

菠萝是重要的热带水果，备受大家关注，但是菠萝基因组序列尚不清楚，现有分子标记不能满足研究需要，这给菠萝基因定位和多态性分析带来了不便。对菠萝进行多态性分析的分子标记方法很多，如SSR、SNP、RFLP等。大多数是借用其它物种现有的分子标记，或对有限的DNA序列进行扫描，查找获得。但是获得的这些标记，针对性不强，没有特异对某一生物途径相关的基因进行标记。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种菠萝成熟衰老相关基因的分子标记方法，通过对菠萝果实衰老过程的RNA进行测序，查找与该事件相关基因的SSR标记。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明采用以下技术方案：

一种菠萝成熟衰老相关基因的分子标记方法，包括以下步骤：

(1)提取采后菠萝衰老过程各阶段的RNA；

(2)通过Illumina Solexa Hiseq2000对菠萝成熟衰老过程中的转录组进行了测序，组装得到了81129个unique基因；

(3)在此基础上使用SSR软件MicroSAtell ite(MISA)进行了SSR扫描，找到了35099个SSR分子标记，供菠萝多态性分析；

(4)对所有SSR重复单元在Unigene上前后序列的长度进行筛选。只保留前后序列均不小于150bp的SSR，用其设计引物；

(5)不同物种间，进行PCR扩增并通过PAGE技术进行多态性检测。

进一步地，所述的步骤(1)中，在此过程植物组织样品不能解冻，提取的RNA质量要求是28S／18S约2倍。

进一步地，所述的步骤(2)中，RNA测序数据量要大于5G以上，质控标准要大于Q20以上。

进一步地，所述的步骤(3)中，分别对1-6个核苷酸组成的重复序列进行筛选。

进一步地，所述的步骤(4)中，引物筛选条件如下：引物不能存在SSR；将获得的引物与Unigene序列比对，引物的5′端允许有1-3个碱基的错配，3′端允许有1个碱基的错配，末端碱基除外；去掉与Unigene序列不匹配的引物，选择唯一匹配的引物；使用SSR_finder校验SSR，使用产物序列来寻找SSR，检验结果是否与MISA结果相同，并筛选出相同的SSR产物。

进一步地，所述的步骤(5)中，优化扩增体系，控制PCR扩增饱和度，避免非特异扩增；PAGE电泳上样量3-5μL。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明针对采后菠萝果实衰老过程的几个阶段，收集提取样品RNA进行测序，获得了菠萝衰老相关的基因表达谱，然后对获得的序列进行SSR标记扫描，确认其多态性。因为这些标记都是同衰老相关基因相连，可以对菠萝不同品种之间的衰老相关性状进行多态性分析。

附图说明：

图1是本发明方法流程图。

图2是本发明原理解释图。

具体实施方式：

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步描述：

图1是本发明方法流程图。一种菠萝成熟衰老相关基因的分子标记方法，包括以下步骤：

(1)提取采后菠萝衰老过程各阶段的RNA；

(2)通过Illumina Solexa Hiseq2000对菠萝成熟衰老过程中的转录组进行了测序，组装得到了81129个unique基因；

(3)在此基础上使用SSR软件MicroSAtellite(MISA)进行了SSR扫描，找到了35099个SSR分子标记，供菠萝多态性分析；

(4)对所有SSR重复单元在Unigene上前后序列的长度进行筛选。只保留前后序列均不小于150bp的SSR，用其设计引物；

(5)不同物种间，进行PCR扩增并通过PAGE技术进行多态性检测。

进一步地，所述的步骤(1)中，在此过程植物组织样品不能解冻，提取的RNA质量要求是28S／18S约2倍。

进一步地，所述的步骤(2)中，RNA测序数据量要大于5G以上，质控标准要大于Q20以上。

进一步地，所述的步骤(3)中，分别对1-6个核苷酸组成的重复序列进行筛选。