[发明专利]一种膨润土单层剥离纳米片组装酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及了一种膨润土单层剥离纳米片组装酶及其制备方法。

背景技术

生物酶是一种高效专一的催化剂，具有反应条件温和、能耗低、副产物少等优点，广泛应用于化学产品（中间体）的制备、纺织印染、环境修复等领域。但是由于酶容易失活、稳定性差、难以回收利用等致命弱点，再加上酶制剂高昂的价格，极大的限制了其在工业化生产中的应用。酶的固定化是一种提高催化稳定性、实现酶循环利用行之有效的方法。但生物酶在固定化过程中，由于载体对酶空间构象产生影响，以及包括空间位阻和传质阻力等影响，其催化活性往往会有所下降。近年来研究发现，在合适的条件下，以水滑石、磷酸锆等层状无机材料为载体负载生物酶蛋白分子可以制备得到高效稳定、具有层状结构的固定化酶。如An等先将层间插入乳酸分子的水滑石剥离，然后将脂肪酶结合到剥离的水滑石片层上，利用水滑石的“记忆功能”，组装成具有层状结构的固定化脂肪酶（AICHE J.2010,56:2677-2686）。中国专利CN1884515A公开了一种纳米片状氧化钛组装酶的方法，该方法利用有机胺剥离层状钛酸盐，得到的纳米片吸附血红蛋白，然后自组装成具有层状结构的固定化酶。另外，氧化还原酶、肌红蛋白等也能通过类似的方法插入到磷酸锆等层状结构中，制备得到催化活性较高、具有层状结构的固定化酶(J.Am.Chem.Soc.2000,122:830-837;J.Am.Chem.Soc.2004,126:14346-14347;Langmuir,2004,20:10231-10237;J.Mater.Chem.2005,15:3838-3843)。但是上述制备过程中，都加入了诸如有机胺、乳酸、氨丙基三乙氧基硅烷等有机化合物，有些还加入强酸强碱，这些对酶蛋白和环境都会产生不利影响。

膨润土作为一种无机层状矿物材料，具有储量丰富、价格低廉、机械强度高、比表面积大、生物相容性好、结构和功能可调等特点，其层状结构由长、宽和高分别约为100nm、100nm和1nm的纳米薄片堆积排列而成，片层之间的层间距约为1.2nm左右。中国专利CN1286719C、CN101823722A和CN101049941A等公开了几种将膨润土层状结构剥离制备无机凝胶的方法，这些方法大都分为离心分离、制浆、改性和胶化等步骤，制备工艺相对比较复杂，主要用于制备应用在石油化工、涂料、造纸和纺织等行业，具有高纯度、高粘度的膨润土无机凝胶。迄今为止，将膨润土剥离用于负载生物酶大分子还未有报道。

目前，膨润土负载生物酶的方法主要有层间插入和外表面吸附两种。Lin等利用聚氧丙烯二胺（POP）等高分子化合物插入到钠基膨润土将其层间距撑开，然后将牛血清白蛋白、α-糜蛋白酶等生物大分子插入层间制备固定化酶（Langmuir,2007,23:1995-1999;J.Phys.Chem.B,2007,111:10275-10280;Bioconjugate Chem.2008,19:138-144）。由于该方法加入了大量的聚合物，对酶蛋白在负载过程中容易产生挤压、干扰以及空间位阻，从而导致酶催化活性的下降。而且，该方法由于无法实现酶分子在载体层间和外表面的可控结合，部分结合在膨润土外表面的酶蛋白很容易脱落，影响酶的催化稳定性。其他已报道的以膨润土为载体制备固定化酶的方法主要是将酶分子直接吸附在膨润土外表面（如图1所示）(Process Biochem.2005,40:2155-2159;Appl.Clay Sci.2008,43:289-295;Appl.Clay Sci.2008,43:308-316;Mater.Sci.Eng.B-Adv.2009,165:173-177;Bioresour.Technol.2010,101:1587-1594)。在此过程中，有部分生物酶的氨基酸残基通过静电吸引、疏水和氢键作用力进入了膨润土层间，但是整个酶分子由于体积太大，无论是钠基膨润土还是有机改性膨润土的层间都无法容纳酶分子进入层间。利用这些方法制备得到的固定化酶，其酶分子大部分吸附在膨润土外表面，直接暴露在反应介质中，而且生物酶与载体之间的疏水、氢键等作用力相对较弱，酶分子之间容易发生聚集和重叠吸附，因此固定化酶催化性能的提高也非常有限。此外，由于生物酶基本没有接触到表面积更大的膨润土片层表面，因此载体对酶的负载量也比较低，造成载体使用效率的低下。本发明人也曾对膨润土及改性膨润土外表面吸附脂肪酶进行了研究，发现该固定化酶的载酶量不高（最大负载量约为80mg/g载体），在水相中的催化活性也远低于游离酶，而且随着负载量的增加固定化酶的催化活性也急剧下降。

发明内容