[发明专利]一种酶促丝素蛋白膜固定化过氧化氢酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶促法丝素蛋白膜固定化过氧化氢酶的方法，是一种利用酪氨酸酶的催化氧化作用，将过氧化氢酶固定化在丝素蛋白膜表面，同时改善膜材料应用性能的方法，属于纺织生物技术领域。

背景技术

蚕丝蛋白具有良好的生物相容性和环境友好性，以丝素蛋白加工的膜材料具有生物降解性好、无毒无刺激性和透气性好等优点，是一种性能优良的生物制品与固定化载体。以丝素蛋白为载体可进行多糖大分子、外源蛋白或生物酶等多种物质的固定化，可采用的方法包括共混包埋法、戊二醛或多元羧酸化学交联法等。与包埋法相比，化学交联法固定化效率较高，制备出的丝素蛋白膜水溶性较低，但应用于生物酶与丝素蛋白交联时易对酶活产生影响，甚至引发酶分子活性位点间的相互交联，使固定化酶的活力下降。此外，部分化学交联还存在反应条件苛刻、易产生化学有害物质残留和环境污染等问题，因此该法在功能型丝素蛋白膜制备中有一定的局限性。

以生物技术进行丝素蛋白功能化改性及膜材料制备，具有高效、专一、反应条件温和及环境友好的优点，逐渐成为材料学科领域研究的热点。酪氨酸酶是一种具有催化氧化活性的含铜多酚氧化酶，能催化氧化具有酚羟基结构的底物形成反应性较强的多巴醌，进而引发底物与伯胺化合物发生接枝。根据这一原理，可借助于酪氨酸酶，催化氧化丝素蛋白中酪氨酸残基产生醌类活性基，引发丝素蛋白分子与外源功能型酶分子发生接枝，实现功能化丝素蛋白膜的生物酶法制备。在上述酶促接枝反应中，丝素蛋白大分子本身也可能在酪氨酸酶的催化条件下发生自身相互交联，使丝素蛋白膜材料的力学性能及化学稳定性进一步提升。

过氧化氢酶是对溶液体系中过氧化氢具有潜在分解功效的生物酶，多应用于体系中残留过氧化氢的去除。根据上述酪氨酸酶的催化特性，可借助于酪氨酸酶催化丝素蛋白与过氧化氢酶进行交联，使后者固定化在丝素蛋白膜表面，结合溶氧仪可定量评价体系中残留的过氧化氢，为基于丝素蛋白材料的载酶生物传感器的制备奠定基础。以丝素蛋白膜为载体构建的生物传感器，不但可进行溶液中过氧化氢的测定，还可实现载酶丝素蛋白膜材料的循环重复再利用，大大节约了过氧化氢酶的成本；另一方面，以丝素蛋白为材料制备的生物传感器对环境较友好，制备方法符合生态环保加工的要求。借助于酪氨酸酶催化丝素蛋白膜接枝过氧化氢酶进行生物传感器制备的方法，目前国内外尚没有报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种环境友好的酶促丝素蛋白膜固定化过氧化氢酶的方法。以本方法制备的载酶丝素蛋白膜，不但能评价溶液体系中过氧化氢浓度，而且可实现循环应用，拓展了丝素蛋白作为功能型生物传感器的应用范畴。为解决上述技术问题，本发明利用酪氨酸酶的催化氧化作用，将过氧化氢酶与丝素蛋白膜接枝，提升功能型丝素蛋白膜的应用性能。

具体工艺如下：

(1)丝素蛋白溶液的制备：以溴化锂或氯化钙溶解丝素纤维，制备丝素溶液。

处理工艺处方及条件：将脱胶后家蚕丝加入到溴化锂或氯化钙的水溶液(乙醇溶液)体系中，在50～80℃左右不断搅拌至溶解(浴比1：5～100)，得到混合丝素溶液；将丝素溶液装入透析袋，以去离子水中透析24～48小时，期间每小时换1次水，透析后过滤，制得丝素水溶液。

(2)丝素蛋白膜的制备：取定量的丝素溶液倒入低界面张力的成膜器皿(如聚四氟乙烯，PTFE)中，通过延流使其平整铺展，在15～85℃条件下干燥1～36小时得到丝素蛋白膜；也可以先将丝素溶液进行冷冻，然后在-50～-20℃条件下采用真空干燥的方式成膜。

(3)酶促丝素蛋白接枝过氧化氢酶：将丝素蛋白膜浸渍在酪氨酸酶和过氧化氢酶的溶液中进行酶促接枝反应。

处理工艺处方及条件：酪氨酸酶用量为1～200U/g丝素蛋白，过氧化氢酶1～200U/g丝素蛋白，温度20～40℃，pH范围6.0～8.0，处理1～24小时。

(4)水洗后处理：酪氨酸酶处理结束后，室温下以去离子水进行丝素蛋白膜水洗，去除丝素蛋白膜表面游离的酪氨酸酶和过氧化氢酶，低温烘干后完成载酶丝素蛋白膜的制备。

一种酶促法丝素蛋白膜固定化过氧化氢酶的方法，特点是丝素溶液制备可选用不同浓度的溴化锂溶液、溴化锂-乙醇水溶液或氯化钙-乙醇水溶液；应用的酪氨酸酶和过氧化氢酶包括了动物、植物和微生物等不同来源的酶品种；丝素蛋白膜酶促改性中，酪氨酸酶和过氧化氢酶既可以先后分步添加至反应体系中，也可采用同时添加的方法进行。

本发明的有益后果