[发明专利]一种利用拟茎点霉对葡萄糖进行生物转化生成松脂醇和松脂醇二葡萄糖苷的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用生物技术将葡萄糖进行转化的方法，属于微生物学领域。 

背景技术

松脂醇和松脂醇二葡萄糖苷是具有抗血压、抗癌、抗氧化等多种生理活性的木脂素化合物，目前只在植物中发现。已有的获得这两种成分的方法主要包括两种，一种是从植物中提取，这种方法需要耗费大量的植株，并且需要经过复杂的提取纯化工艺才可以获得较高产量和纯度的产品；另一种方法是半化学合成，需要经过较为复杂的化学合成工艺路线，使用多种有机化学原料，整个制备过程存在一定的有机毒性，并且所得产物容易有中间杂质掺入，影响产品药学性能。 

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种利用拟茎点霉对葡萄糖进行生物转化获得松脂醇和松脂醇二葡萄糖苷(PDG)的方法，能够快速、有效、低成本的实现生产松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇，整个生产过程环保无污染，可实现工业化大规模生产，同时也可以用于对菌株的PDG合成途径改造和调控研究。 

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的： 

一种利用拟茎点霉对葡萄糖进行生物转化的方法，包括下述步骤：1)拟茎点霉制成冻干菌体；2)将冻干菌体加入含葡萄糖的无菌水中，摇瓶振荡进行生物转化反应；3)转化培养后，离心除去菌体，将转化液进行真空浓缩，加入乙醇醇沉过夜后过滤去除多糖及其他杂质，蒸发至干即可得松脂醇二葡萄糖苷。 

在本发明中，所采用的拟茎点霉名为XP-8，中国专利保藏号为Phomopsis sp.CCTCC M209291，关于该菌种的来源、基金序列、分类等信息申请人公开于ApplMicrobiolBiotechnol杂志，文章名为Structure identification and fermentation characteristicsofpinoresinoldiglucoside produced by Phomopsissp.isolated from Eucommiaulmoides01iv，电子版本公开于2011年11月3日，印刷版本刊载于2012年93期p1475—1483。本领域技术人员可从西北农林科技大学食品学院购买此菌种，同时申请人声明资本发明申请日起20年内向申请人可向公众提供该菌种。 

进一步的，申请人发现在上述基础上，步骤2)在将冻干菌体加入含葡萄糖的无菌水中后可加入松柏醇和／或松脂醇单葡萄糖苷从而得到松脂醇。 

申请人对上述生物转化过程的条件进行了优化研究，得出了较为有效的进行生物转化的条件为：步骤2)采用的无菌水葡萄糖浓度为0.5—5％，菌体浓度为0.1—1％，转化时间为2—20小时。 

通过进一步的优化研究，申请人发现了最优化的生物转化条件为转化时间12.51小时，葡萄糖浓度1.32％，菌体浓度0.29％。 

同样的，申请人对实现生物转化成松脂醇的条件进行了研究发现在下述浓度下能实现较好的转化时间和产率：所用松柏醇和／或松脂醇单葡萄糖苷的浓度为0.1-10mmol／L，最优选为1mmol／L。 

通过本发明的技术方案，本发明实现了以生物转化为基础，以葡萄糖等为原料，快速、有效地生产松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇。 

附图说明

图1为标准品和样品中松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇的液相色谱图，其中1为标准品松脂醇二葡萄糖苷的色谱峰，2为标准品松脂醇的色谱峰，3为样品中松脂醇二葡萄糖苷色谱峰，4为样品中松脂醇的色谱峰。 

图2为标准品和样品中松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇的二级质谱图，其中A、B分别是标准品和样品中松脂醇二葡萄糖苷的二级质谱；C、D分别是标准品和样品中松脂醇的二级质谱。 

具体实施方式

1.1材料： 

菌株拟茎点霉XP-1；PDG标准品，购于中国药品生物制品检定所，松脂醇标准品，购于Sigma；乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，购于sigma；琼脂(B.R)，葡萄糖(A.R)，95％乙醇(A.R)等购于陕西西陇化工。 

1.2方法 

1.2.1冻干菌体的制备：将保存的拟茎点霉XP-1的斜面菌种接种于PDA平板培养基上，在28℃下培养活化5d；用直径为1cm的无菌打孔器打孔取种，接入4—6片到装有100mL PDB培养基的250mL的摇瓶中，在28℃、180r／min下摇床 培养5d作为种子液。再以10％接种量接入新的PDB培养基中，装液量100mL／250mL，在28℃、180r／min下摇床培养5d。