[发明专利]肿瘤坏死因子α因子蛋白的全序列及其蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肿瘤坏死因子α因子蛋白的全序列及其蛋白的制备方法，尤其涉及一种池蝶蚌的脂多糖诱导的肿瘤坏死因子α因子(Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor,LITAF)蛋白的全序列及其蛋白的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

脂多糖诱导的肿瘤坏死因子α因子(Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor,LITAF)是一种转录因子，它可调控肿瘤坏死因子TNF-a转录表达，引起多种炎症反应和肿瘤细胞发生细胞凋亡。

我国是水产养殖大国，以池蝶蚌等为育珠蚌的珍珠养殖是我国水产养殖的主导产业之一。池蝶蚌等淡水贝类具有个体大、营养丰富等特点，其提取物还具有免疫调节、抗癌等多种生物学活性效应。目前国内外已通过提取贝类多糖等生理活性物质，开发出了保健食品和药品。但以上提取物由于贝类体内本身含量低等原因，以及提取制备步骤繁琐、工艺复杂等原因，目前多为纯度较低的多糖等物质的混合物，具有一定免疫调节等功效，但对肿瘤细胞的毒性作用较低，对其功效及副作用药理和毒理研究尚缺乏认识。而利用现代基因工程技术开发的池蝶蚌中LITAF重组蛋白产品，对人类来源的肿瘤细胞如A549等细胞株具有特异性和安全性高、杀伤性好、来源稳定和易于贮存等优点，并具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种池蝶蚌的脂多糖诱导的肿瘤坏死因子α因子(Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor,LITAF)蛋白的全序列及其蛋白的制备方法，通过设计扩增池蝶蚌中LITAF开放阅读框序列的寡核苷酸引物，获得了池蝶蚌中LITAF蛋白的全序列。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：一种肿瘤坏死因子α因子蛋白的全序列，具有序列表中SEQ ID NO.1所示的来自于α因子体内的LITAF蛋白的核酸全序列和具有序列表中SEQ ID NO.2所示的来自于α因子体内的LITAF蛋白的氨基酸序列。

肿瘤坏死因子蛋白的制备方法，包括如下步骤：提取池蝶蚌的总RNA，反转录成cDNA后，以该cDNA为模板，利用设计好的寡聚核苷酸引物序列，进行聚合酶链式反应（PCR），得到编码LITAF蛋白的基因全序列；构建重组表达载体pET-32c(+)-LITAF，转化大肠杆菌感受态BL21（DE3），经鉴定为阳性后，在体外利用0.1mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）于30℃诱导LITAF蛋白表达；最后分离纯化目的蛋白，获得LITAF重组蛋白，所制备得到的蛋白具有序列表中SEQ ID NO.1所示的来自于池蝶蚌体内特有的LITAF蛋白的核酸全序列及SEQ ID NO.2所示的来自于池蝶蚌体内特有的LITAF蛋白的氨基酸序列。

所述步骤具体为：

1）以池蝶蚌的cDNA为模板，设计扩增LITAF基因的引物，利用该引物进行聚合酶链式反应，得到编码LITAF蛋白的基因全序列；

2）利用基因重组技术将LITAF基因片段克隆到pMD19-T载体中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET-32c(+)原核表达载体相连接，获得表达重组载体pET-32c(+)-LITAF；该重组载体转化大肠杆菌感受态BL21（DE3），经扩大培养，利用PCR法筛选、鉴定阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的重组表达载体pET-32c(+)-LITAF；

3）取阳性重组质粒pET-32c(+)-LITAF，在体外利用0.1mmol/LIPTG于30℃，6h诱导LITAF蛋白表达；利用Western-blot和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法鉴定目的蛋白；

4）用组氨酸亲和层析柱法分离纯化目的蛋白，从而获得LITAF重组蛋白。

本发明的有益效果为：本发明设计了扩增池蝶蚌中LITAF编码序列的寡聚核苷酸引物，获得了池蝶蚌中LITAF蛋白的全序列，所得到的LITAF重组蛋白是利用基因工程技术开发的池蝶蚌中LITAF蛋白产品，对人类肿瘤细胞A549等多种肿瘤细胞具有细胞毒性强、特异性高、安全性好、可大量重复生产和易于贮存等优点，LITAF重组蛋白可用于制备新型基因工程抗癌药物，防治人类癌症，具有广阔的市场前景。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步骤的说明。