[发明专利]呼吸道合胞病毒检测试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

一种呼吸道合胞病毒检测试剂盒及其检测方法，属于酶免疫分析技术领域。

背景技术

目前国内检测呼吸道合胞病毒(RSV)感染方法有电镜检测、培养鉴定法、聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫吸附试验、凝集法、荧光免疫特异性抗体检测法等，文献指出在各种方法中，抗原较抗体检测更敏感。临床实验室常用间接免疫荧光法检测RSV，其次还有病毒分离培养法，PCR法，病毒细胞培养需要的时间长、费用高，有时甚至几周才能出结果，不适合临床检验，间接免疫荧光法操作简单，方便，适合于临床实验室检测RSV，以德国欧蒙公司为代表的试剂盒应用最普遍，该方法为用RSV感染的细胞作为抗原，人体内产生的RSV抗体与受RSV感染的细胞反应，加入标记异硫氰酸荧光素的羊抗人IgM，实验前需用驴抗人IgG抗体吸附抗呼吸道合胞病毒IgG抗体，此法的最大缺点是体内IgG抗体的非特异性结合，造成假阳性，结果不易判读。

发明内容

本发明的目的是提供一种样品前处理简单，快速、灵敏、准确的检测呼吸道合胞病毒的方法。

本发明试剂盒主要由盒体(1)，酶标板(2)中设有反应孔(3)的板条，A试剂瓶(分泌物前处理液)(4)，B试剂瓶(生物素化抗呼吸道合胞病毒抗体)(5)，C试剂瓶(含Triton X-100的磷酸盐缓冲液)(6)，D试剂瓶(链霉亲和素偶联过氧化物酶复合物)(7)，E试剂瓶(邻苯二胺OPD试剂)(8)，F试剂瓶(H₂O₂)(9)，G试剂瓶(硫酸溶液)(10)，塑料托架(11)及酶标板(2)均安放在盒体(1)内。

本发明用咽拭子擦拭患儿咽部，加入到2ml含有30g/L盐酸氨溴索磷酸盐缓冲液中剧烈震荡，静至60min，高速离心(10000G，10min)，取沉淀物加入到2.0ml含1.0％(V/V)Triton X-100的磷酸盐缓冲液中，静置30min，剧烈震荡，使呼吸道合胞病毒从咽上皮细胞脱落出来，取50μl上清液加入到呼吸道合胞病毒ELISA反应板中，37℃水浴箱水浴30min，洗涤5次；加入50μl生物素化抗呼吸道合胞病毒抗体，37℃水浴箱水浴30min，洗涤5次；加入链霉亲和素偶联过氧化物酶复合物，37℃水浴箱水浴30min，洗涤5次；加入试剂E、F各50μl，至37℃水浴箱水浴10min，加1滴终止液酶标仪测定A_490nm值。

在本发明中，该试剂盒检测的标本是鼻咽分泌物中上皮细胞，其中，盐酸氨溴索药物为粘液溶解剂，临床上常用于呼吸科病人降低痰液的粘稠度而易于排出，本品的巯基(-SH)结构可使粘蛋白的双硫(-S-S-)结构断裂，降低痰粘度，在本发明中，经盐酸氨溴索作用使咽部上皮细胞从粘液中分离开。Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)是一种非离子型表面活性剂，分子量为646.86(分子式为C₃₄H₆₂O₁₁)，它能溶解脂质，增加对细胞膜的通透性，RSV寄生于口腔咽部活体细胞内，Triton X-100作用于细胞膜使RSV病毒从细胞中脱离出来，在链霉亲和素-生物素偶联ELISA法检测中，链霉亲和素-生物素系统是一种具有高亲和力、灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点的信号放大标记技术，研究证明链霉亲和素-生物素依靠接触表面均一的多层膜来维持其稳定的结合，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的抗体可通过其生物素连接多个链霉亲和素分子，一个链霉亲和素分子又可桥联多个酶分子，由于此法能结合更多酶标记物，放大了检测信号，使检测灵敏度放大1000倍，因此，能检测病毒载量低的咽部上皮细胞，特别适合呼吸道合胞病毒早期感染。

本文采用将生物素-链霉亲和素系统引入ELISA检测系统，经特殊处理咽部上皮细胞，利用该系统的放大效应和链霉亲和素-酶复合物具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性强等特点，提高了检测灵敏度，特别适合早期感染的诊治，具有重要临床价值，并可应用该技术平台检测SARS病毒，H7N9病毒等其它病毒检测，具有重要意义。

具体实施方式

一、呼吸道合胞病毒酶标板的制备

将抗呼吸道合胞病毒抗体用包被液稀释成1∶200倍，加入100μl包被微孔反应板的微孔，加入含1％小牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液350μl/每孔，室温封闭2小时，4℃过夜。甩尽孔内液体后，用洗涤液洗3次，每次3分钟。二、生物素化抗体的制备