[发明专利]血清中甘油三酯的甘油脱氢酶测定方法

说明书

技术领域

本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪检测血清中甘油三酯的甘油脱氢酶测定方法。

背景技术

血清中甘油三脂(TG)的测定方法一般可分为化学法、酶法和色谱法3大类。早期测定方法是以总脂质与胆固醇和磷脂之差估算。比较准确的是二氯甲烷-硅酸-变色酸法(Van Handel-Caslson法)，此法抽提完全、能去除磷脂及甘油干扰、变色酸显色灵敏度高、显色稳定，至今还是美国疾病控制与预防中心(CDC)的内部参考方法。但因操作步骤繁多、技术要求高而不适于临床常规检测工作中应用。色谱法包括核素稀释/气相色谱/质谱等方法(ID/GC/MS)，主要用作参考系统中决定性方法的建立及参考物质的制备与定值，此法费用昂贵，样品处理复杂，难以推广应用，应用高效液相色谱仪测定血清中的甘油三酯，检测成本高，难以在临床推广。

目前国内几乎所有的临床实验室都用酶法检测血清TG水平，此方法分为一步法和两步法，虽然方法各异，但一般都包括以下几个基本反应步骤：用最合适的脂蛋白脂肪酶(LPL)水解TG生成甘油和脂肪酸；水解后的甘油和三磷酸腺苷(ATP)在甘油激酶(GK)和甘油磷酸氧化酶(GPO)的催化下生成H₂O₂，在过氧化物酶(POD)的催化下，H₂O₂，4-氨基安替比林(4-AAP)和2，4-二氯酚形成有色染料(常为醌亚胺类)，这些物质的生成量与样本中的甘油三酯含量成正比。本发明采用甘油脱氢酶为工具酶，是将试剂分成两部分，仅以脂蛋白脂肪酶为第二试剂，由于试剂组成成分加入顺序不同，对甘油三酯测定结果产生不同效果，具有消除游离甘油干扰的特性，本法应用工具酶少，降低杂酶干扰和试剂成本等优点，具体反应步骤如下：

第一步反应：

第二步反应：

临床实验室检测血清中TG采用的是酶法，在本发明中，血清中游离甘油与试剂I中NAD⁺在甘油脱氢酶作用下生成NADH和二羟丙酮，完成第一步反应后加入试剂II，甘油三酯经脂蛋白脂肪酶水解成甘油和脂肪酸，生成的甘油与试剂中NAD⁺在甘油脱氢酶作用下生成NADH和二羟丙酮，完成第二步反应，仪器以第一步反应为空白，以第二步反应为测定反应，计算出甘油三酯的值即为真正甘油三酯的值。

发明内容：

为了解决现有技术中血清中TG的测定方法存在内源性甘油干扰的问题，本发明提供一种经济方便易行，准确性更高、能够消除内源性甘油影响的血清甘油三酯的测定方法。

采用的技术方案是：甘油脱氢酶及NAD⁺同在试剂I中，试剂II仅含有脂蛋白脂肪酶有效成分；血清先与试剂I于37℃温浴3～5分钟，血清中游离甘油与试剂I的反应生成NADH，加入试剂II后于37℃温浴4～7分钟，甘油三酯水解后经反应也生成NADH；仪器在334～340nm波长处检测，以试剂I反应产生的NADH为空白，由试剂II反应产生的NADH计算出甘油三酯的含量。

上述试剂I和试剂II中碳酸盐缓冲液的pH值为10.5～11.5，该酸碱度可以有效解决产物抑制造成的反应不全，使反应达到平衡，利于测定反应进行。

上述测定中反应物的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶70～80∶20～30。

在本发明中，该试剂盒的线性范围为：11.6mmol/L，样品体积为2μl，试剂I为150μl，试剂II为50μl，第一步反应时间为3分钟，第二步反应时间为5分钟，根据酶动力学方程，试剂II中每升缓冲液溶解脂蛋白脂肪酶1950U/L，0.12g Triton X-100，200μl Proclin-300防腐剂；试剂I中每升缓冲液溶解甘油脱氢酶45000U/L，NAD⁺10mmol，200μl Proclin-300防腐剂。